ГОСТ 33645—2015
4.1.4 Помимо отбора головастиков по стадии развития можно дополнительно использовать отбор
тестовых организмов по размеру. С этой целью на сутки 0 измеряют полную длину тела (не SVL) для
подгруппы в выборке примерно 20 NF стадии 51 головастиков. После расчета средней полной длины
тела для этой группы организмов могут быть установлены минимальный и максимальный пределы для
полной длины тела тестовых организмов, с допуском диапазона среднего значения
±
3 мм (средние
значения диапазона полной длины тела от 24.0 до 28.1 мм для стадии 51 головастиков). Тем не менее
определение стадии развития является основным параметром в определении пригодности каждого те
стового организма к испытанию. Головастиков с макроскопически видимыми пороками развития или
травмами из испытания исключают.
4.1.5 Головастиков, которые отвечают критериям для требуемой в испытании стадии развития,
описанным выше, содержат в резервуаре с чистой культуральной водой, пока не завершается процесс
определения стадии развития других особей. После завершения определения стадии развития личинок
произвольно распределяют в испытуемые резервуары для воздействия, пока каждый резервуар не бу
дет содержать 20 личинок. Затем каждый испытуемый резервуар проверяют на наличие головастиков
с аномальным внешним видом (например, травмы, аномальное плавательное поведение и т. д.). Голо
вастиков с подобными идругими отклонениями удаляют из испытуемых резервуаров и заменяют вновь
выбранными личинками из резервуара, в котором были объединены личинки.
4.2 Наблюдения
4.2.1 Для получения более подробной информации о процедурах по завершению испытания и
обработке головастиков следует обратиться к Руководству ОЭСР по гистологии щитовидной железы
земноводных [10].
7-е сутки испытания
4.2.2 На 7-е сутки из каждого испытуемого резервуара извлекают пять произвольно выбранных
головастиков из каждой повторности. Произвольный характер процедуры обеспечивает возможность
выбора любого организма в испытании с одинаковой вероятностью. Это достигается использованием
любого метода рандомизации, но требуется, чтобы каждый головастик быть учтен. Неотобранных го
ловастиков возвращают в исходный резервуар и гуманно усыпляют с использованием 150-200 мг/л,
например. MS-222, соответствующим образом забуференного бикарбонатом натрия до достижения
pH 7.0. Подвергнутых эвтаназии головастиков промывают водой и высушивают с последующим опреде
лением массы тела с округлением до ближайшего целого числа в миллиграммах. Длину задних конеч
ностей, длину от кончика морды до клоаки и стадию развития (с помощью бинокулярного микроскопа)
определяют для каждого головастика.
21-е сутки испытания (окончание испытания)
4.2.3 По окончании испытания (21 сут) оставшихся головастиков удаляют из испытуемых резерву
аров и гуманно усыпляют, например. 150-200 мг/л MS-222. соответствующим образом забуференным
бикарбонатом натрия, как описано выше. Головастиков промывают водой и высушивают с последую
щим определением массы тела с округлением до ближайшего целого значения в миллиграммах. Опре
деляют стадию развития. SVL и длину задних конечностей у каждого головастика.
4.2.4 Всех личинок помещают в фиксатор Дэвидсона на 48-72 ч. в виде цельных образцов или
образцов с усеченными тканями головы, содержащими нижнюю челюсть для гистологической оценки.
Для гистопатологических исследований в общей сложности отбирают пять головастиков из каждого
параллельного резервуара. Поскольку высота фолликулярных клеток зависит от стадии развития (11), то
наиболее подходящим методом отбора проб для гистологического анализа является использование
особей соответствующей стадии развития, когда это возможно. Для того чтобы выбрать особей соот
ветствующей стадии, у всех личинок вначале, еще до отбора и последующей обработки для сбора и
хранения данных определяют стадию развития. Это необходимо, поскольку нормальные колебания в
развитии могут привести в результате к различному распределению по стадии развития в каждом па
раллельном резервуаре.
4.2.5 Головастики, отобранные для гистопатологических исследований (п = 5 из каждой повторно
сти). должны соответствовать средней стадии развития в контроле (объединенные повторности), когда
это возможно. Если имеются параллельные резервуары с более чем пятью личинками на соответству
ющей стадии, то произвольно выбирают пять личинок.
4.2.6 Если имеются параллельные резервуары с менее чем пятью личинками на соответствующей
стадии развития, то произвольно отбирают особей со следующей более низкой или более высокой
8