ГОСТ 32635-2014
Наивысшая концентрация должна вызывать цитотоксичность на уровне 55 ± 5 %. Высокие
концентрации могут индуцировать хромосомные нарушения, которые являются вторичным эффектом
цитотоксичности [61]. При выявлении цитотоксичности, исследуемые концентрации должны быть в
диапазоне от концентрации, вызывающей цитотоксичность 55 ♦ 5 %, до концентрацией
с минимальной цитотоксичностью или отсутствием цитотоксичности.
Если не наблюдается цитотоксичность или преципитация, максимальные концентрации следует
брать 0,01М. 5 мг/мл или 5 мкл/мл, выбирая из них наименьшую. Интервал между выбранными
концентрациями следует брать не более \’Ю. Для веществ, у которых выявляется крутая зависимость
концентрация-эффект, возможно использование более узкого интервала между концентрациями,
анализируя культуры со средним и низким уровнем токсичности.
Когда ограничивающим фактором является растворимость, максимальная концентрация, если
не ограничивает цитотоксичность, берется на уровне наименьшей концентрации, при которой в
культуре отмечается минимальная преципитация, не мешающая анализу препарата. Оценка
преципитации проводится методами световой микроскопии, при выявлении преципитации, которая
персистирует. или появлению приципитации во время культивирования (в конце воздействия).
4.6 Контроли
В каждый опыт для вариантов с и без метаболической активации должны быть включены
позитивные контроли и контроли с растворителем/разбавителем.
Позитивные контроля необходимы, чтобы показать способность использованных клеток и
протокола тестирования выявлять кластогены и анеугены и подтвердить метаболическую
способность препарата S9. Позитивные контроли выбираются из известных веществ, индуцирующих
образование микроядер в концентрациях, которые вызывают небольшое, но воспроизводимое
повышение эффекта над контролем и демонстрируют чувствительность тест-системы. Концентрации
позитивных контролей подбирают так, чтобы эффект был четким, но не позволял исследователю
сразу идентифицировать зашифрованный препарат.
Кластогены, которым необходима метаболическая активация (например, циклофосфамид,
бенэ(а)пирен), следует использовать, чтобы показать как метаболическую компетентность, так и
способность теста идентифицировать кластогены. При обосновании можно использовать другие
вещества для позитивного контроля. Поскольку некоторые позитивные контроли. которые нуждаются в
метаболической активации, могут быть активны без экзогенной метаболической активации при
определенных условиях воздействия или в определенных клеточных линиях, необходимость
метаболической активации и активность S9 препаратов следует исследовать в выбранных клеточных
линиях и при отобранных концентрациях.
В настоящее время не известны анеугены, которые требуют метаболической активации для
проявления генотоксической активности [17]. К веществам, принятым как позитивный контроль для
оценки анеугенной активности, относятся, например, колхицин и винбластин. Можно использовать
другие вещества, если они индуцируют микроядра исключительно или в основном через анеугенную
активность. Чтобы избежать необходимости двух контролей (для кластогенности и анеугенности) без
метаболической активации, анеугенный контроль может применяться как позитивный в вариантах без
S9, а контроль кластогенности может использоваться для оценки адекватности используемой
системы метаболической активации. Позитивные контроли на кластогенность и анеугенность следует
использовать на клетках, которые не требуют S9. Предполагаемые позитивные контроли приведены в
Приложении Б.
Может допускаться использование веществ химически связанного класса с известными
позитивнымиконтролями.Всеиспользуемыевеществапозитивногоконтролядолжны
соответствовать типу клеток и условиям активации.
Контроль с растворителем/разбавителем должен присутствовать для каждого времени
фиксации. Дополнительно, негативный контроль без обработки также может ставиться, пока
опубликованные данные или исторический контроль лаборатории не покажет, что растворитель в
использованных концентрациях не индуцирует генотоксические и другие вредные эффекты.
5 Проведение теста
5.1 Схема обработки
Для того, чтобы максимизировать вероятность выявления анеугена или кластогена, активных в
специфических стадиях клеточного цикла, необходимо, чтобы достаточное число клеток было
обработано исследуемым веществом в течение всех стадий клеточного цикла. Схемы обработки для
клеточных линий и первичных клеточных культур могут отличаться от таковой для лимфоцитов,
которые требуют стимуляции митогеном. для начала клеточного цикла [17].
5