ГОСТ 32635-2014
Первичные клетки и клеточные линии обрабатывают сходным способом, что и лимфоциты, за
исключением того, что нет необходимости стимуляции их ФГА и обрабатывать через 44—48 часов.
Клетки, кроме лимфоцитов, следует обрабатывать в таком режиме, чтобы во время окончания
обработки клетки еще находились в логарифмической фазе роста.
5.3 Клеточные линии без ЦХВ
Клетки следует обрабатывать 3-6 часов в присутствии и отсутствии ЦХВ. Среду с веществом
удаляют и замещают свежей средой, содержащей ЦХВ. Клетки фиксируют через промежуток времени
1,5—2.0 нормального клеточного цикла.
Если начальные тесты с коротким (3-6 часов) периодом обработки показали отрицательный или
сомнительный результат, используют протокол с длительной экспозицией без S9. Подходят 2
варианта обработки. Оба варианта одинаково приемлемы.
- Вариант А. Клетки обрабатывают исследуемым веществом в течение 1.5—2.0 нормального
клеточного цикла и фиксируют в конце периода экспозиции.
- Вариант Б. Клетки обрабатывают исследуемым веществом в течение 1.5—2.0 нормального
клеточного цикла. Среду с веществом удаляют и замещают свежей средой. Клетки фиксируют через
дополнительный промежуток времени 1.5—2.0 нормального клеточного цикла.
В монослое митотические клетки (идентифицируются как шарообразные образования и
отделяющиеся от поверхности) могут появляться в конце 3—6 часовой обработки. Так как эти
митотические клетки легко отделяются, их можно потерять, при удалении среды, содержащей
исследуемое вещество. Следует тщательно собрать их при отмывании культуры и вернуть их в
культуру, чтобы избежать потерь клеток, находящихся в митозе, которые ко времени фиксации
являются клетками риска для микроядер.
5.4 Число культур
По две культуры следует использовать для каждой концентрации исследуемого вещества и для
контрольных культур с растворителем/разбавителем и негативного контроля. Когда предыдущие
данные лаборатории показывают минимальные вариации между двумя культурами, можно
использовать в опыте одну культуру. При использовании в опыте одной культуры рекомендуется
увеличить число анализируемых концентраций.
5.5 Фиксация клеток и приготовление препаратов
Каждуюкультуруфиксируют отдельно.Приготовлениепрепаратовможетвключать
гипотоническую обработку. Однако этот этап не обязателен, если достигается адекватный разброс
клеток. Можно использовать различные методики приготовления препаратов, которые позволяют
получать препараты высокого качества для анализа. Должна сохраняться цитоплазма клеток, чтобы
определять микроядра и (при методе блока цитокинеза) реально идентифицировать двуядерные
клетки.
Можно использовать различные методы окраски препаратов, такие как Гимза или
специфические к ДНК флуоресцентные красители [60]. Использование специфичных красителей к
ДНК (например, акридин оранж [62] или Hoechst 33258 плюс пиронин-Y [63]) может убрать ряд
артефактов, связанных с применением не специфичных к ДНК красителям. Анти-кинетохорные
антитела. FISH с панцентромерными ДНК зондами или in situ мечение с панцентромеры
специфическими праймерами, в сочетании с соответствующими красителями могут быть
использованы для идентификации содержания (хромосома/фрагменты хромосомы) микроядер, если
интересует информация по механизму их формирования [16. 17]. Возможно использование других
методов дифференцировки между кластогенами и анеугенами. если показана их эффективность.
5.6 Анализ
Перед микроскопическим анализом все препараты, включая с растворителем/разбавителем и
контроли, должны быть независимо зашифрованы. Альтернативно, шифруются пробы, которые
анализируются адекватными системами проточной цитометрии или анализа изображения.
В культурах с ЦХВ для оценки частоты микроядер следует анализировать минимум 2000
двуядерных клеток на концентрацию (минимум 1000 двуядерных клеток на культуру при постановке
двух культур на концентрацию). В опытах с одной культурой минимум 2000 двуядерных клеток на
концентрацию следует анализировать в этой культуре. Если на каждую концентрацию учитывается
существенно меньше, чем 1000 двуядерных клеток на культуру или менее 2000. при постановке
одной культуры, и если не выявлено значимого повышения частоты микроядер, опыт должен быть
повторен, используя больше клеток для анализа или менее токсичные концентрации. Не следует
учитывать клетки неправильной формы или с двумя ядрами, значительно различающимися в
размерах. Не следует путать двуядерные клетки с плохо разбросанными многоядерными клетками.
Клетки, содержащие более чем два ядра не должны анализироваться на микроядра, так как исходная
(спонтанная) частота микроядер в этих клетках может быть выше [64, 65]. Возможен подсчет
одноядерных клеток, если показано, что исследуемое вещество влияет на активность ЦХВ.
7