ГОСТ 32635-2014
Введение
Микроядерный тест in vitro (МЯТ) - метод оценки генотоксичмости по выявлению микроядер в
цитоплазме имтерфазных клеток. Микроядра могут образовывать ацентрические фрагменты
хромосом (т.е. с отсутствием центромеры) или целые хромосомы, которые не способны мигрировать к
полюсам на стадии анафазы клеточного деления. Метод оценивает кластогенную и анеугенную
активность химических веществ [2. 3] в клетках, которые проходят клеточное деление во время или
после экспозиции исследуемого вещества. Данное руководство касается использования протоколов
без или с применением ингибитора актин полимеразы цитохолазина В (ЦХБ). Добавление ЦХБ перед
изучаемым митозом позволяет идентифицировать и проводить анализ частоты микроядер в клетках,
которые прошли один митоз, т.к. такие клетки двуядерны [4. 5). Это руководство также дает описание
протокола без блока цитокинеза при условии наличия данных, что анализируемая клеточная
популяция митотически активна.
В дополннении к использованиюМЯТ для идентификации индуцирующих микроядра
химических веществ, цитокинезный блок, иммунохимическое меченио кинетохоров или гибридизация
с центромерными/теломерными зондами (флуоресцентная гибридизация in situ (FISH)) позволяют
получить информацию по механизмам хромосомных нарушений и образования микроядер (6, 7, 8. 9, 10.
11. 12, 13. 14. 15. 16. 17]. Процедуры мечения и гибридизации можно использовать в случаях, когда
имеется повышение образования микроядер и исследователь хочет выяснить, является ли это
возрастание результатом кластогенных и/или анеугенных событий.
Микроядра представляют собой нарушения хромосом, которые передаются дочерним клеткам,
тогда как аберрации хромосом, анализируемые в метафазных клетках, могут не передаваться.
Поскольку выявление микроядер в интерфазных клетках достаточно объективно, сотрудникам
лабораторий необходимо определить прошла или не прошла клетка клеточное деление и как много
клеток содержит микроядра. В результате анализ препаратов проводится относительно быстро и
может быть автоматизирован. На практике это позволяет анализировать тысячи, а не сотни, клеток на
экспериментальную точку, увеличивая силу метода. Наконец, поскольку микроядра могут
образовывать отставшие хромосомы, возникает возможность выявлять агенты, индуцирующие
анеуплоидию, что трудно оценивать в стандартном тесте на хромосомные аберрации, (например,
Руководство OECD 473 [18]). Однако МЯТ не позволяет выявлять вещества, индуцирующие
полиплоидию, от веществ, которые индуцируют кластогенность. без специальных методик, таких как
FISH.
МЯТ - является методом in vitro, который проводится на культивируемых клетках человека и
грызунов. Тест дает полное основание исследовать хромосомные нарушения in vitro, поскольку
выявляет как анеугены, так и кластогены.
МЯТ надежен и эффективен в различных типах клеток как в присутствии, так и отсутствии ЦХВ.
Имеется большое количество данных, показывающих приемлемость МЯТ при использовании
различных линий клеток грызунов (СНО. V79. CHL/IU и L5178Y) и лимфоцитов человека [19, 20. 21,
22, 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32]. Они включают Международное исследование по валидации
теста, координируемое the Soci6te Francaise de Toxicologie Gen6tique (SFTG) [19. 20. 21. 22. 23] и
доклады Международных совещаний по генетическому тестированию [5, 17]. Все приемлемые
данные были также повторно оценены в weight-of-evidence ретроспективном валидационном
исследовании Европейского центра по валидизации альтернативных методов (ECVAM) Европейской
Комиссии (ЕС). Метод тестирования был рекомендован как научно обоснованный ECVAM Scientific
Advisory Committee (ESAC) [33, 34, 35]. Имеются данные по использованию клеточной линии
лимфобластных клеток человека ТК6 [36]. HepG2 клеток [37. 38] и первичных эмбриональных клеток
сирийского хомячка [39]. хотя они не проходили валидизациониое исследование.
IV