ГОСТ 32635-2014
обосновано данными, показывающими его совместимость с исследуемым веществом и отсутствие у
него генетической активности. Рекомендуется, если возможно, использовать в первую очередь
водные растворы/суспензии.
4.5.2 Использование ЦХВ как блокатора цитокинеза
Одним из важнейших моментов проведения МЯТ является гарантия того, что анализируемые
клетки прошли митоз во время обработки или в период инкубации после обработки, если его
использовали в методике. ЦХВ -вещество, которое наиболее широко используется для
блокирования цитокинеза, так как он подавляет сборку актина и таким образом препятствует
разделению дочерних клеток после митоза, приводя к формированию двуядерных клеток [6. 55. 56).
Поэтому, подсчет микроядер может быть ограничен клетками, которые прошли митоз во время или
после воздействия. Одновременно можно оценить действие вещества на кинетику пролиферации.
ЦХВ следует использовать как блокатор цитокинеза в опытах с лимфоцитами человека, так как
длительность клеточного цикла может варьировать между культурами и между донорами и не все
лимфоциты будут отвечать на ФГА. Когда тестируют клеточные линии, другие методики использует,
чтобы определить, прошли ли учитываемые клетки деление. Это рассмотрено ниже.
Необходимые концентрации ЦХВ следует определить в лаборатории для каждого типа клеток,
чтобыдостичьоптимальнойчастотыдвуядерныхклетоквконтрольныхкультурахс
растворителем/разбавителем. Обычно приемлемая концентрация ЦХВ находится в диапазоне между 3
и 6 мкг/мл.
4.5.3 Измерение клеточной пролиферации и цитотоксичности и выбор экспозиционных
концентраций
При определении максимальной исследуемой концентрации вещества следует избегать
концентраций, которые могут вызвать искусственный положительный ответ, вызывая сильную
цитотоксичность, преципитацию в культуральной среде и заметное изменение pH и осмотической
концентрации [40. 41.42].
Анализ клеточной пролиферации проводится для того, чтобы установить, что клетки находились
в митозе во время обработки и что воздействие привело к приемлемому уровню цитотоксичности.
Цитотоксичность следует оценивать в вариантах с и без метаболической активации в клетках,
которые не требуют метаболической активации, используя относительное возрастание количества
клеток (RICC) и относительное удвоение популяции (RPD) (см. Приложение 1 для формул), когда не
используется ЦХВ. Когда используется ЦХВ. цитотоксичность может быть определена используя
индекс репликации (RI) (см. Приложение А для формул).
Обработка культур ЦХВ и определение относительных частот одноядерных, двуядерных и
многоядерных клеток в культуре, является точным мотодом установления количественного эффекта
воздействия на клеточную пролиферацию, цитостатическую и цитотоксическую активность [6] и
позволяет анализировать только клетки, которые делились во время или после воздействия.
В исследованиях с ЦХВ цитотостатичность/цитотоксичность можно количественно оценить
индексом пролиферации при цитокинезном блоке (CBPI) [6. 27, 57] или вывести из RI при анализе 500
клеток на культуру. Эти параметры, наряду с другими, можно использовать при оценке
цитотоксичности, сравнивая величины в экспериментальных и контрольных культурах. Оценка других
показателей цитотоксичности (слияние, число клеток, апоптоз, некроз, подсчет метафаз) также дает
полезную информацию.
В экспериментах без ЦХВ необходимо показать, что анализируемые клетки прошли деление во
время или после воздействия исследуемым веществом. Если это не сделать, то могут быть получены
ложноотрицательные результаты. Методы, которые используются для установления того, что были
проанализированы делящиеся клетки, включают инкорпорациюи последующее выявление
бромдезоксиуридина (БДУ). для идентификации клеток, которые реплицировались [58]. образование
клонов, когда обрабатываются клетки перевиваемых клеточных линий и подсчитывается in situ под
микроскопом стекло (индекс пролиферации (PI)) [26. 27, 28. 29] или определяется относительное
удвоение популяции (RPD) или относительное возрастание количества клеток (RICC) или другими
обоснованными методами [17. 57. 59. 60] (см. Приложение А для формул). Оценка других
показателей цитотоксичности (слияние, число клеток, апоптоз, некроз, подсчет метафаз) также дает
полезную информацию.
Должны быть оценены по крайней мере 3 концентрации, которые позволяют провести анализ.
Для достижения этого возможно необходимо провести эксперимент, используя большое число близко
ранжированныхконцентраций.и анализировать микроядра при концентрациях, проявивших
подходящий уровень цитотоксичности. Альтернативная стратегия - проведение предварительного
эксперимента по оценке цитотоксичности, чтобы ограничить диапазон концентраций для основного
теста.
4