ГОСТ 32635-2014
Теоретические подходы вместе с опубликованными данными [19] показывают, что большинство
анеугенов и кластогенов будут выявлены при коротком периоде обработки, от 3 до 6 часов, в
присутствии и отсутствии S9. последующем удалении исследуемого соединения и периоде роста в
течение 1.5 - 2.0 клеточных циклов [7]. После начала или окончания обработки клетки фиксируют
через промежуток времени, эквивалентный приблизительно 1.5-2.0-кратной продолжительности
нормального (т.е. без обработки) клеточного цикла, (см. Таблицу 1). Время фиксации или
восстановления может быть увеличено, если известно или ожидается, что вещество нарушает
продолжительность клеточного цикла (например, при исследовании аналогов нуклеоэидов).
Из-за потенциальной цитотоксичностипрепаратов S9длякультивируемых клеток
млекопитающих длительность экспозиции 1.5-2.0 нормального клеточного цикла используется только в
вариантах с отсутствием S9. Существует мнение, что при длительной экспозиции можно проводить
обработку клеток химическим веществом при отсутствии и в присутствии ЦХВ. Это мнение относится к
ситуациям, когда предполагается возможное взаимодействие между исследуемым веществом и
ЦХВ.
Предлагаемая схема обработки клеток представлена в таблице 1. Эти общие схемы обработки
можно модифицировать в зависимости от стабильности и реакционной способности исследуемого
вещества или особых характеристик роста используемых клеточных линий. Все виды обработки
культуры должны начинаться и заканчиваться в период, когда клетки растут экспоненциально.
Т а б л и ц а1 Время обработки клеток и фиксации в МЯТ тесте.
Лимфоциты, первичные♦S9Длительность обработки 3-6 часа в присутствии S9;
клеточные культуры и удаление S9 и среды с веществом:
клеточныелиниисдобавление свежей среды и ЦХВ;
введением ЦХВфиксация черезпромежуток времени1.5-2.0
нормального клеточного цикла.
-S9,
кратковременная
экспозиция
-S9,
длительная
экспозиция
Длительность обработки 3-6 часа;
удаление среды с веществом;
добавление свежей среды и ЦХВ;
фиксация черезпромежуток времени1,5-2.0
нормального клеточного цикла.
ВариантА.Обработка1.5-2.0нормального
клеточного цикла в присутствии ЦХВ;
Фиксация в конце периода экспозиции.
ВариантБ:Обработка1.5-2,0нормального
клеточного цикла;
удаление исследованного вещества;
добавление свежей среды и ЦХВ;
фиксация черезпромежуток времени1.5-2.0
нормального клеточного цикла.
Клеточные линии обрабатываются без ЦХВ
(Схемы введения идентичны представленным выше, за исключением того, что ЦХВ не
добавляется).
5.2 Лимфоциты, первичные клетки и клеточные линии с ЦХВ.
Для лимфоцитов наиболее эффективный подход - начать экспозицию исследуемым веществом
через 44-48 часов после стимуляции ФГА, когда исчезает синхронизация клеточного цикла [6]. В
начальном эксперименте клетки обрабатывают исследуемым веществом от 3 до 6 часов в отсутствии
или присутствии S9. Затем среду с веществом удаляют и замещают свежей средой, содержащей
ЦХВ. Клетки фиксируют через промежуток времени 1,5-2.0 нормального клеточного цикла.
Если начальные тесты с коротким (3-6 часов) периодом обработки показали отрицательный или
сомнительный результат, используют протокол с длительной экспозицией без S9. Одинаково
приемлемы 2 варианта обработки. Однако, возможно для стимулированных лимфоцитов более
подходит Вариант А. когда экспоненциальный рост может снижаться к 96 часу после стимуляции. Также
в культурах клеток не следует достигать слипания при выборе времени фиксации в Варианте Б.
- Вариант А. Клетки обрабатывают исследуемым веществом в течение 1,5—2.0 нормального
клеточного цикла и фиксируют в конце периода экспозиции.
- Вариант Б. Клетки обрабатывают исследуемым веществом в течение 1,5—2.0 нормального
клеточного цикла. Среду с веществом удаляют и замещают свежей средой. Клетки фиксируют через
дополнительный промежуток времени 1.5 — 2.0 нормального клеточного цикла.
6