ГОСТ 32635-2014
чувствительность метода, рекомендуются использовать типы клеток с низкой, стабильной спонтанной
частотой образования микроядер.
Лимфоциты человека следует отбирать у молодых (возраст приблизительно 18-35 лет),
здоровых, некурящих индивидов, которые не имели недавнего контакта с генотоксическими
химическими веществами и радиацией. Если клетки более чем одного донора объединяют для
использования, число доноров должно быть указано. Частота микроядер возрастает с возрастом
индивидов и этот тренд более заметен у женщин, чем у мужчин [45). Это следует принимать во
внимание при отборе доноров для объединения.
4.2 Среды и условия культивирования
Необходимо использовать соответствующую культуральную среду и условия инкубации
(культуральная посуда, температура, концентрация С02 и влажность). Перевиваемые клеточные
линии и штаммы должны обычно проверяться на стабильность модального числа хромосом и
отсутствие контаминации микоплазмой. Не следует использовать культуры, если выявлена
контаминация микоплазмой или модальное число хромосом изменено. Должна быть известна
нормальная продолжительность клеточного цикла для условий культивирования, используемых в
лаборатории. Если используется метод цитокинетического блока, то концентрация ингибитора
цитокинеза должна быть оптимизирована для каждого типа клеток и должно быть показано, что
имеется хороший для анализа выход двуядерных клеток.
4.3 Подготовка культур
4.3.1 Перевиваемые клеточные линии и штаммы
Клетки отбирают из исходных (сток) культур, высевают в культуральную среду в плотности,
такой, чтобы культура не достигла слияния в монослое, а суспензионные культуры не достигли
избыточной плотности, перед временем фиксации. Клетки инкубируют при 37 С.
4.3.2 Лимфоциты
Цельную кровь, обработанную антикоагулянтом (например, гепарином), или выделенные
лимфоциты культивируют в присутствии митогена фитогемагглютинина (ФГА) перед воздействием
исследуемого вещества и ЦХВ.
4.4 Метаболическая активация
При работе с клетками, у которых отсутствует адекватная эндогенная метаболическая система,
следует использовать систему экзогенной метаболической активации. Наиболее часто используемая
система включает кофакторы и постмитохондриальную фракцию (S9) печени грызунов, обработанных
индукторами ферментов такими как Arochtor 1254 [46. 47] или комбинацию фенобарбитала и (i-
нафтофлавона [47. 48. 49. 50]. Последняя комбинация не противоречит Стокгольмской конвенции по
стойким органическим загрязнениям [51] и, как было показано, так же эффективна как Arochlor 1254
по индукции оксигеназ смешанной функции [47. 48. 49. 50]. Обычно S9 фракцию используют в
концентрации в диапазоне 1 % — 10 % от конечного объема среды. Условия системы
метаболической активации зависят от класса тестируемого химического соединения. В некоторых
случаях возможно проведение опыта с более, чем одной концентрацией постмитохондриальной
фракции.
Генетически инженерные клеточные линии, экспрессирующие специфические активирующие
ферменты человека или грызунов, могут ограничить необходимость применения экзогенных систем
метаболической активации и могут быть использованы в данной тест системе. В этом случае выбор
клеточных линий должен быть научно обоснован, например, пригодность оксидаз смешанной
функции для метаболизма исследуемого вещества [52] и по ответу при тестировании известных
кластогенов и анеугенов (смотри раздел «Критерии приемлемости»). Следует помнить, что
тестируемое вещество может не метаболизироваться экспрессируемыми оксидазами смешанной
функции. В этом случае отрицательный результат не указывает на то. что вещество не индуцирует
микроядра.
4.4.1 Подготовка исследуомого вещества
Твердые вещества необходимо растворять в соответствующих растворителях или разбавителях
и разводить перед обработкой клеток. Газообразные и летучие соединения следует тестировать при
соответствующих модификациях стандартного протокола, таких как обработка в закупоренных
сосудах [53, 54]. Свежие препараты должны использоваться до тех пор. пока не будут
получены данные об их стабильности при соответствующих условиях хранения.
4.5 Условия тестирования
4.5.1 Растворитель/разбавитель
Растворитель/разбавитель не должен химически взаимодействовать с исследуемым веществом
и не должен влиять на выживаемость клеток и активность S9 системы в используемых
концентрациях. Если, помимо хорошо изученных (например, вода, культуральная среда,
диметлсульфоксид), используется другой растворитель/разбавитель. его применение должно
быть
3