ГОСТ 32635-2014
В опытах с клеточными линиями без ЦХВ. микроядра анализируют минимум в 2000 клетках на
концентрацию (минимум 1000 клеток на культуру при постановке двух культур на концентрацию). В
опытах с постановкой одной культуры на концентрацию анализируют минимум 2000 клеток на
культуру.
При использовании ЦХВ следует определять CBPI или RI для оценки клеточной пролиферации
(см. Приложение А), анализируя минимум 500 клеток на культуру. При воздействии в отсутствии ЦХВ.
следует получить данные, что клетки, которые анализируют, имели пролиферацию.
5.7 Критерии приемлемости
Описанные в данном руководстве лабораторные правила использования МЯТ теста показывают
его возможность реально и точно выявлять вещества с известной анеугенной и кластогенной
активностью в условиях с и без метаболической активации, а также известные негативные вещества,
используемые в качестве контрольных соединений (Приложение Б). Когда получены данные по
возможности корректно выполнять данный тест, лаборатория должна показать, что анализируемые
на микроядра клетки прошли одно клеточное деление, если тест проводится без использования ЦХВ.
Вещества, представленные в Приложении Б. рекомендуются использовать в качестве
контрольных соединений. Может быть проведена замена или дополнение, если известна активность
этих веществ, если у них сходный механизм действия и если они относятся к веществам, которые
будут тестированы, используя методику МЯТ. Обоснование может включать валидационное
исследование, включающее широкий спектр веществ, или сфокусированное на сужение спектра,
основанное на химическом классе исследованного вещества или изученном механизме нарушений.
Контроль с растворителем/разбавителем и контроль без обработки должны давать
воспроизводимо низкий и постоянный уровень частоты микроядер (типично 5-25 микроядер на 1000
клеток для клеточных типов). Другие типы клеток могут иметь разные уровни ответов, которые
следует определить, когда обосновывается возможность использования их в МЯТ тесте. Данные
контролей позитивного, негативно и с растворителем следует использовать для установления
пределов колебаний исторического контроля. Эти оценки необходимо использовать при решении
вопроса об адекватности соответствующих негативных/позитивных контролей в эксперименте.
Если предполагаются минорные изменения протокола эксперимента (например, методики
автоматического анализа, использование нового типа клеток), то. если их эффективность показана до
модификации протокола, они могут считаться приемлемыми для использования. Демонстрация
эффективности включает показ того, что главные механизмы, хромосомные разрывы и отставания и
потери могут быть определены, и что соответствующие позитивные и негативные результаты могут
быть получены для тестируемого класса отдельных веществ или широкого ряда веществ.
6 Результаты и отчет
6.1 Обработка результатов
Если используется методика цитокинезного блока, то для оценки индукции микроядер
используется только частота двуядерных клеток с микроядрами (независимо от числа микроядер на
клетку). Учет числа клеток с одним, двумя и более микроядрами может дать полезную информацию, но
не обязателен.
Параллельно следует проводить оценку цитотоксичности и/или цитостатичности во всех
обработанных и контрольных с растворителем/разбавителем культурах [59]. Необходимо рассчитать
CBPI или RI для всех обработанных и контрольных культур, как меру задержки клеточного цикла при
использовании метода цитокинетического блока. В отсутствии ЦХВ. следует использовать RPD или
RICC или PI (см. Приложение 1).
Данные приводят по отдельным культурам. Дополнительно, все данные следует объединить
(суммировать) в табличной форме.
Вещества, которые индуцируют микроядра в МЯТ. индуцируют хромосомные разрывы, потери
хромосом или комбинацию этих событий. Дальнейший анализ с применением анти-кииетохорных
антител, специфических центромерных зондов in situ или других методов может использоваться для
установления механизма индукции микроядер, вследствие кластогенного и/или анеугенного
эффектов.
6.2 Оценка и интерпретация результатов
Нет требований по дополнительному тестированию для верификации четко положительного
илиотрицательногоответа.Противоречивыерезультатыследуетпрояснить,проводя
дополнительный анализ 1000 клеток из всех культур, чтобы избежать потери слепого
тестирования. Если это не разрешает ситуацию следует провести дальнейшее тестирование. В
последующих экспериментах следует модифицировать параметры исследования, расширяя или
сужая колебания условий. Параметры исследования, которые могут быть модифицированы
включают диапазон
8