ГОСТ Р ИСО 20776-1—2022
ние плотности инокулюма может быть проведено как с помощью фотометрического устройства (исполь
зуют длину волны 625 нм и кювету с длиной пути световой волны 1 см, абсорбция составит 0,08—0,13), так
и с помощью должным образом откалиброванного нефелометра. Такой же результат может быть
достигнут путем визуального сравнения четкости линий черного цвета при просмотре их через иноку-
люм и суспензию с мутностью, эквивалентной 0,5 по МакФарланду (инокулюм и стандарт МакФарланда
должны находиться в пробирках одного и того же размера) или любым другим методом, который дает
воспроизводимую концентрацию КОЕ/мл. Конечный инокулюм должен содержать 5 * 105 КОЕ/мл (це
левой диапазон от 2 х 105до 8 * 105 КОЕ/мл).
Примечание 1— 0,5 стандарта МакФарланда можно приготовить путем добавления к 0,5 мл раствора
ВаС12концентрацией 0,048 моль/л (1,175 %-ный раствор ВаС12 •2Н20) медленно при тщательном перемешивании
99,5 мл раствора серной кислоты (H2S04) концентрацией 0,18 моль/л (1 %-ный раствор) до получения гомогенной
суспензии.
4.4.3 Метод прямого суспендирования колоний
Стерильной петлей касаются нескольких морфологически сходных колоний, выросших на несе
лективной питательной агаровой среде, инкубированной при температуре (35 ± 1) °С в течение 12— 18 ч
(если более длительная инкубация не требуется), переносят в стерильный бульон или физио логический
раствор. Суспензию доводят до мутности, эквивалентной 0,5 по стандарту МакФарланда (см. 4.4.2).
Для всех микроорганизмов точная концентрация жизнеспособных клеток (КОЕ/мл) в окончатель
ном инокулюме зависит от фазы роста культуры. Этот эффект наиболее выражен у прихотливых микро
организмов, таких как Streptococcus pneumoniae, когда при использовании старых культур может значи
тельно сократиться число жизнеспособных клеток в суспензии.
При использовании любого метода точно доведенная до нужной плотности суспензия должна со
держать от 1 х ю 8до 2 х ю 8 КОЕ/мл для широко распространенных значимых бактерий.
Доведенный до необходимой плотности инокулюм, приготовленный, как указано выше, разводят
в бульоне до получения окончательной концентрации клеток 5
х
Ю5 КОЕ/мл (диапазон — от 2
х
ю 5до
8 х ю 5 КОЕ/мл). Необходимое разведение зависит от исследуемого микроорганизма и метода, исполь
зуемого для подготовки инокулюма. При добавлении 0,1 мл стандартизированной суспензии микроор
ганизма в пробирку, содержащую 9,9 мл бульона (разведение 1:100), получают суспензию с концентра
цией клеток 1 х ю 6 КОЕ/мл, которую в объеме 50 мкл добавляют к равному объему (50 мкл) раствора
антимикробного препарата, и получают окончательную плотность инокулюма 5 х Ю5 КОЕ/мл для боль
шинства грамотрицательных бактерий (например, Escherichia coli). Если лунки уже содержат по 100 мкл
бульона с антимикробным препаратом, соответствующее разведение, необходимое для обеспечения
требуемой окончательной концентрации инокулюма, должно быть приготовлено перед добавлением
разведенной суспензии в объеме не более 10 мкл в каждую лунку. В соответствии с результатом под
счета колоний при проведении предварительных исследований [5] могут применяться альтернативные
разведения суспензии плотностью 0,5 по стандарту МакФарланда.
4.5 Инокулирование планшетов для микроразведений
Суспензию следует инокулировать в планшеты не позднее чем в течение 30 мин после ее приго
товления для сохранения числа жизнеспособных клеток в КОЕ/мл. В каждую лунку, содержащую 50 мкл
раствора антимикробного препарата, разведенного в бульоне (см. 4.3), добавляют 50 мкл бактериаль ной
суспензии (см. 4.4). В лунки планшета, содержащие по 100 мкл бульон с раствором антимикробного
препарата, должно быть добавлено не более чем по 10 мкл разведенной суспензии инокулюма.
Для контроля содержания необходимого числа клеток — около 5 х Ю5 КОЕ/мл — в лунке следу
ет выполнить подсчет жизнеспособных клеток в исследуемой суспензии. Для этого немедленно после
инокулирования из лунки для контроля роста берут 10 мкл содержимого и переносят в пробирку с
10 мл бульона или физиологического раствора. 100 мкл этого разведения распределяют по поверх
ности соответствующего агара в чашке, которую затем инкубируют с вечера и всю ночь (12— 18 ч). При
достижении в исследуемой суспензии плотности 0,5 по стандарту МакФарланда ожидается рост от
20 до 80 колоний. При получении другого результата необходимо предпринять корректирующие
действия для обеспечения подготовки инокулюма необходимой плотности.
5