ГОСТ 33539—2015
Таблица 3 — Термоциклические условия для ПЦР с праймерами PVT-labv-3F/PVT-labv-3R
Температура,°СВремя
Число циклов
955 мин
1
35
9530 с
6030 с
7230 с
725 мин
1
Анализ результатов ПЦР осуществляют с применением горизонтального электрофореза в 2%-ном
агарозном геле. При положительном анализе обнаруживают ампликоны молекулярной массой 330 п. н.
для пары праймеров PVT-1/PVT-2 и 278 п. н. для пары праймеров PVT-labv-3F/PVT-labv-3R.
8.4.3.3 Электрофорез продуктов амплификации
При электрофорезе продуктов амплификации готовят 2%-ный агарозный гель в буферном рас
творе 0,5* ТАЕ по 7.1.3.2. Наносят капли загрузочного буферного раствора по 7.1.3.3 объемом 3 мм3 на
пленку Парафилм, добавляют к капле 20 мм3 продукта амплификации и тщательно перемешива ют,
вносят продукты амплификации, включая положительный и отрицательный контроли, в лунки геля. В
первую лунку геля вносят ДНК-маркер с молекулярной массой 100 п. н.
Проводят электрофорез в течение 20 мин при напряжении 120 В (для геля 15^10 см) или в тече
ние 40 мин при напряжении 160 В (для геля 15 х 25 см) в буферном растворе 0,5х ТАЕ. Погружают гель
в раствор бромистого этидия по 7.1.3.4 на 20 мин. Просматривают гель на ультрафиолетовом транс
иллюминаторе.
8.5 Биологический метод идентификации
8.5.1 Сущность метода
Биологический метод идентификации вируса Т картофеля представлен тестом на индикаторных
растениях.
Сущность теста на индикаторных растениях заключается в приготовлении смеси исследуемого
образца растения с фосфатным буферным раствором по 7.1.4.1, инокуляции полученной смесью ин
дикаторных растений с целью последующего обнаружения специфических симптомов заражения виру
сом Т картофеля.
8.5.2 Подготовка проб
Исследуемый образец растения, отобранный по 7.2.2, массой 1 г гомогенизируют в пластико
вом контейнере с 10 см3 с фосфатным буферным раствором по 7.1.2.1 на гомогенизаторе в течение
2—5 мин или с помощью фарфоровой ступки и пестика до получения однородной суспензии.
8.5.3 Проведение теста
Подготовленную пробу растительного материала, полученную по 8.5.2, наносят шпателем на по
верхность листьев индикаторных растений, предварительно опудренных карбидом кремния.
Для исследования одного образца используют не менее двух молодых (в стадии от трех до шести
листьев) энергично растущих растений каждого вида индикаторных растений.
После инокуляции индикаторных растений остатки инокулюма смывают с листьев дистиллиро
ванной водой с целью предотвращения появления ожогов.
Примечание — За один день до инокуляции и в течение от одного до двух дней после инокуляции ин
дикаторные растения притеняют, например, используя для этого бумагу.
По одному растению каждого вида индикаторных растений опудривают карбидом кремния, обра
батывают стерильной дистиллированной водой и оставляют неинокулированными в качестве контроля.
Инокулированные индикаторные растения содержат в теплице или климатической камере при
температуре от 18 до 25 °С в течение трех — четырех недель и осматривают на наличие симптомов
вируса Т картофеля не менее одного раза в неделю.
Зараженность вирусом Т картофеля исследуемых образцов растений идентифицируют по нали
чию симптомов, представленных в таблице 4.
14