ГОСТ 33539—2015
8.2.2.3 В репродукционных посадках семенного картофеля обследование проводят путем осмотра
образцов растений по диагонали поля. Пробой считают 20 образцов растений, осматриваемых подряд на
одном ряду. Объем выборки проб и образцов — по 7.2.3.3.
В случае обнаружения симптомов поражения вирусом Т картофеля на листьях растений (см. ри
сунок Б.1, приложение Б), проводят отбор образцов по 7.2 для последующей идентификации в соот
ветствии с 8.3 и 8.4.
После завершения обследования составляют акт, который подписывают представитель хозяйства
и обследователь.
8.3Серологический метод выявления и идентификации
8.3.1 Сущность метода
Серологический метод исследования вируса Т картофеля представлен твердофазным ИФА в мо
дификации DAS-ELISA.
Сущность метода ИФА заключается в выявлении в образце иммунного комплекса «антиген —
антитело» к вирусу Т картофеля путем присоединения к одному из компонентов реакции фермента
тивной метки с последующей ее детекцией в сравнении с положительными и отрицательными кон-
тролями.
8.3.2 Подготовка проб
Исследуемый образец растения, отобранный по 7.2.1, массой 1 г гомогенизируют в пластико
вом контейнере с 10 см3 экстрагирующего буферного раствора по 7.1.2.3 на гомогенизаторе в течение
2—5 мин или с помощью фарфоровой ступки и пестика до получения однородной суспензии и
осветля ют центрифугированием в течение 5 мин при скорости 2000 об/мин с охлаждением до 5 °С.
8.3.3 Проведение исследования
Твердофазный ИФА в модификации DAS-ELISA на выявление вируса Т картофеля проводят с ис
пользованием тест-систем и специфических поликлональных антител в соответствии с инструкциями
изготовителей.
Готовят рекомендуемое разведение кроличьих поликлональных антител в карбонатном буфер
ном растворе по 7.1.2.4 и вносят по 200 мм3 в каждую лунку планшета, используя дозаторы со сменны
ми одноразовыми наконечниками.
Планшет закрывают и инкубируют в термостатируемом встряхивателе при температуре 37 °С в
течение 4 ч или при температуре 4 °С в течение 16 ч и трижды промывают лунки планшета промывоч ным
буферным раствором по 7.1.2.2.
Вносят в каждую лунку планшета по 200 мм3 пробы растительного экстракта, полученной по 8.3.2.
Используют по две лунки для каждого образца и для положительного контроля и не менее двух лунок для
отрицательного контроля. Лунки маркируют.
Планшет закрывают и инкубируют в холодильной камере при температуре 4 °С в течение 16 ч и
трижды промывают лунки планшета промывочным буферным раствором.
Готовят рекомендуемое разведение конъюгата антител в буферном растворе для конъюгата по 7.1.2.6.
Вносят в каждую лунку планшета по 200 мм3 поликлональных антител, конъюгированных с ще
лочной фосфатазой.
Планшет закрывают и инкубируют в термостатируемом встряхивателе при температуре 37 °С в
течение 3 ч и трижды промывают лунки планшета промывочным буферным раствором.
Готовят раствор субстрата для щелочной фосфатазы (1 мг р-нитрофенилфосфата на 1 см3 суб
стратного буферного раствора по 7.1.2.7) и вносят по 200 мм3 в каждую лунку планшета.
Планшет закрывают и инкубируют при температуре от 18 до 25 °С, затем считывают показания на
иммуноферментном фотометрическом анализаторе при длине волны 405 нм через 30, 60, 90 и 120 мин.
8.3.4 Обработка результатов
Результат исследования считают отрицательным, если значение абсорбции образца не более
двукратного значения абсорбции в отрицательном контроле.
8.4 Молекулярный метод выявления и идентификации
8.4.1 Сущность метода
Сущность молекулярного метода исследования вируса Т картофеля заключается в выявлении ви
руса в образце путем многократного избирательного копирования определенного участка нуклеиновой
кислоты при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro) в целях обнаружения чужеродной
для образца РНК вируса.
12