ГОСТ 33539—2015
8.4.2 Подготовка к исследованию
8.4.2.1 Для ОТ рекомендуется использовать готовые наборы реагентов (мастер-миксы). Приготов
ление реакционных смесей осуществляют с помощью микроцентрифуги-встряхивателя в соответствии с
инструкциями изготовителей.
8.4.2.2 Для ПЦР рекомендуется использовать готовые наборы реагентов (мастер-миксы). При
готовление реакционных смесей осуществляют с помощью микроцентрифуги-встряхивателя в соответ
ствии с инструкциями изготовителей.
8.4.2.3 Подготовка проб
При проведении ПЦР используют свежие или замороженные (хранящиеся при температуре от
минус 20 до минус 80 °С) листья.
При проведении ПЦР с ОТ из исследуемого образца растения, отобранного по 7.2.1, проводят вы
деление РНК с использованием наборов реагентов для выделения нуклеиновых кислот в соответствии с
инструкциями изготовителей.
8.4.3 Проведение исследования
8.4.3.1 ПЦР с ОТ с использованием специфических праймеров PVT-1/PVT-2
Реакцию ОТ проводят при термоциклических условиях, указанных в таблице 1.
Таблица 1— Термоциклические условия для проведения реакции ОТ
Первый этап ОТ
Реакция ОТ
Режим ОТ
Вода стерильная
3 мм3
При температуре 70 °С
в течение 5 мин.
При температуре 4 °С
в течение 5 мин
ПраймерыRandom dN10
0,5 мм3
Oligo dT17
0,5 мм3
РНК
5 мм3
Второй этап ОТ
Вода стерильная
1 мм3
При температуре 40 °С
в течение 60 мин.
При температуре 70 °С
втечение 10 мин
5* буферный раствор для синтеза
первой цепи кДНК
4 мм3
dNTPs
2 мм3
ДТТ
2 мм3
Ревертаза MMLV
2 мм3
Примечание — При использовании наборов реагентов с модифицированной ревертазой MMLV
или ревертазой AMV термоциклические условия реакции корректируют в соответствии с инструкциями
изготовителей.
ПЦР проводят на амплификаторе при термоциклических условиях, указанных в таблице 2.
Таблица 2 — Термоциклические условия для ПЦР с праймерами PVT-1/PVT-2
Температура, °СВремя
Число циклов
954 мин
1
35
9530 с
6230 с
72 1 мин
7210 мин
1
8.4.3.2 ПЦР с ОТ с использованием специфических праймеров PVT-labv-3F/PVT-labv-3R
Реакцию ОТ проводят при термоциклических условиях, указанных в таблице 1.
ПЦР проводят на амплификаторе при термоциклических условиях, указанных в таблице 3.
13