ГОСТ Р 56144—2014
микропробирке добавляют 30 мм3 75 %-мого изопропилового спирта и инкубируют в течение 20 мин
при комнатной температуре.
14.1.2 Микропробирки с полученной по 14.1.1 смесью центрифугируют при 14000 об/мин в
течение 20 мин и удаляют надосадочную жидкость.
14.1.3 К полученному осадку добавляют 100 мм3 75 %-ного изопропилового спирта,
центрифугируют при 14000 об./мин в течение двух минут и удаляют надосадочную жидкость.
14.1.4 Высушивают полученный по 14.1.3 осадок в термостате при температуре 65 °С в течение
10 мин и растворяют в 20 мм3формамида по 5.3.
14.1.5 Полученные анализируемые пробы в формамиде переносят в 96-луночный планшет,
закрывают уплотнителем и подвергают тепловой денатурации при температуре 95 °С в течение 3
мин. а затем при температуре 4 °С — в течение 5 мин.
14.2 Проведение капиллярного элоктрофореза
14.2.1 Подготовленные в соответствии с 14.1 анализируемые пробы, содержащие продукты
секвенирования,разделяютметодомкапиллярногоэлектрофорезасдетекциейсигнала
флюоресценции.
14.2.2 Подготовку, все этапы испытания и интерпретацию результатов выполняют в
соответствии с инструкцией по эксплуатации генетического анализатора по 5.2.
14.2.3 Программное обеспечение генетического анализатора автоматически анализирует
полученные сигналы (хроматограммы) и определяет последовательность нуклеотидов. Результатом
анализа является расшифрованная последовательность нуклеотидов, приведенная над пиками
хроматограммы в формате abiфайла.
14.3 Контроль качества секвенирования
14.3.1 Для оценки качества секвенирования. поиска причин и путей устранения проблем
рекомендуется использовать примеры типовых результатов, приведенные в приложении А. Для
последующей идентификации вакцинных штаммов в соответствии с разделом 15 используют
нуклеотидные последовательности на хроматограммах, полученных по 14.2.3. с высокой
интенсивностью сигнала флюоресценции и хорошо разделенными пиками.
14.3.2 Дополнительно вручную проверяют корректность чтения нуклеотидов в целях исключения
ошибки автоматического анализа. Удаляют плохо читаемые из-за всплесков фона нуклеотиды в
начале хроматограммы и область праймера на конце секвенируемого ПЦР-продукта. В случае
присутствиянахроматограммевнекоторыхпозицияхнуклеотиднойпоследовательности
генетической неоднородности устанавливают обозначение неопределенного нуклеотида «А/» (см.
таблицу А.1, пункт 5).
14.3.3Подтверждаютдостоверностьопределениянуклеотиднойпоследовательности,
объединяя перекрывающиеся фрагменты с прямого и обратного праймеров с помощью алгоритма
CLUSTAL
15 Идентификация вирусных штаммов и интерпретация результатов
испытания
15.1 Для идентификации штаммов вирусов испытуемых вакцин сравнивают полученную в
соответствии с разделом 14 нуклеотидную последовательность фрагмента генома с известными
последовательностями вирусных штаммов.
15.2Дляпоискагомологичныхпоследовательностейсравниваютнуклеотидную
последовательностьфрагментагенома вакцинногоштамма втекстовом форматес
последовательностями, имеющимися в базах данных с использованием алгоритма BLAST. Отчет о
поиске представляется в виде списка последовательностей штаммов/изолятов. с которыми
полученная в результате испытания нуклеотидная последовательность имеет наибольшую
гомологию.
В случае если нуклеотидная последовательность фрагмента генома штамма вируса
испытуемой вакцины отсутствует в базах данных, обращаются к—производителю вакцины для
получения дополнительной информации о генетической структуре штамма.
15.3 Если полученная нуклеотидная последовательность имеет 100 %-ную гомологию с
аналогичным участком генома штамма вируса, заявленного в сопроводительной документации
16