ГОСТ Р 56144—2014
11 Детекция ПЦР-продуктов методом электрофореза в агарозном геле
11.1 Подготовка к испытанию
11.1.1 Готовят рабочий электрофорезный буфер: в мерный цилиндр вливают 50 см3 ТБЭ-
буфера, доводят дистиллированной водой до 500 см3и перемешивают.
11.1.2 Берут 1.7 г агарозы для электрофореза ДНК. помещают в стеклянную колбу из
термостойкого стекла вместимостью 250 см3. Наливают 100 см3 рабочего электрофорезного буфера по
11.1.1, перемешивают вращением колбы и плавят в микроволновой печи до полного растворения
агарозы. Время плавления агарозы в микроволновой печи мощностью 800 Вт при ее загруженности
одной колбой — 1.5 мин.
11.1.3 Вынимают колбу с расплавленной агарозой из микроволновой печи, аккуратно
перемешивают, вращая колбу.
11.1.4 После этого вновь помещают колбу с агарозой в микроволновую печь на 1.5 мин (при
мощности 800 Вт), доводят агарозу до кипения.
11.1.5 Вынимают колбу из микроволновой печи и остужают агарозу до температуры 65 °С — 70
°С. вращая колбу.
11.1.6 К раствору агарозы, полученному по 11.1.5. добавляют 5 мм3раствора бромистого этидия
концентрацией 10 мг/см3, тщательно перемешивают раствор. Полученный агарозный гель используют
для заливки в рамку камеры.
11.1.7 Выравнивают столик для заливки гелей, заливают агарозный гель, полученный по 11.1.6,
в рамку камеры.
11.1.8 Устанавливают гребенки, не касаясь дна рамки камеры, на расстоянии не менее 3 см друг
от друга. Толщина агарозного геля должна быть около 0.6 см.
11.1.9 После полного застывания агарозного геля (30 мин при комнатной температуре),
осторожно вынимают из него гребенки, не повредив лунки. Помещают рамку с готовым агарозным
гелем в камеру так. чтобы лунки располагались ближе к отрицательному электроду. Заливают в
камеру рабочий электрофореэный буфер по 11.1.1 так. чтобы он полностью покрыл агарозный гель.
11.2 Проведение электрофореза
11.2.1 Из пробирок с продуктами амплификации по 10.7 отбирают по 10 мм3анализируемых проб
и вносят в лунки агарозного геля. В каждом ряду лунок агарозного геля обязательно вносят К+ и
маркер молекулярных масс ДНК по 5.3.
11.2.2 Подключают камеру к источнику тока, соблюдая полярность (ДНК должна двигаться в
направлении положительного электрода). Электрофорез проводят при напряжении от 180 до 250 В в
течение 2 0 — 30 мин, при этом краситель крезоловый красный, входящий в «ПЦРсмесь-2», должен
продвинуться не менее чем на 2 см от старта. Оптимальная напряженность электрического поля при
этом составляет 10 В/см.
11.2.3 По завершении времени электрофореза выключают источник тока, переносят рамку с
гелем на УФ трансиллюминатор, расположив полосы горизонтально лунками вверх. Получают
изображение агарозного геля (электрофореграмму) на компьютере с помощью видеосистемы.
12 Учет результатов ПЦР
12.1 Учет результатов ПЦР проводят по наличию или отсутствию на электрофореграмме
специфических полос амплифицированной ДНК. Длина амплифицированных специфических
фрагментов ДНК:
- фрагмента F-гена вируса НБ — 442 п. н.:
- фрагмента M-гена вируса НБ — 1051 п. н.;
- фрагмента S-гена вируса ИБК — 467 п. н.;
- фрагмента УР2-гена вируса ИББ — 743 п. н.
Длина фрагмента ВКО указана в инструкции по его применению.
12.2 Учет начинают с оценки результатов амплификации положительных и отрицательных
контролей по ГОСТ Р 52833 в соответствии с таблицей 5.
13