ГОСТ Р 56144—2014
Т а б л и ц а 3 — Праймеры для идентификации штаммов вируса ИББ
Наименование
праймера
Направление
праймера
Последовательность
Положение
IBDV-VP2-1
Прямой
5’-GGCCCAGAGTCTACACCATAAC-3’
735 — 756
IBDV-VP2-2
Обратный
5’-CCGGATTATGTCTTTGAAGCC-3’
1477 — 1457
Указаны позиции первого и последнего нуклеотида соответствующего праймера относительно
последовательности генома вируса ИББ с регистрационным номером JO411012в базах данных.
10.4 Для проведения ПЦР готовят мастермикс «ПЦР-смесь-1», смешивая по 0,10 см3растворов
прямого и обратного ПЦР-лраймеров. 0.25 см3раствора дНТФ и 0.05 см3деионизованной воды.
10.5 Эффективность экстракции РНК и реакции ОТ проверяют с помощью ПЦР-выявления в
анализируемых пробах ВКО, добавленного на этапе экстракции РНК по 8.2.
10.6 Для ПЦР используют среднестениые микропробирки вместимостью 0.6 см3 или
тонкостенные вместимостью 0.2 см3 в зависимости от типа амплификатора. Для повышения
специфичности применяют «горячий старт» с восковой прослойкой, для чего воск расплавляют в
термостате при температуре 90 °С.
10.7 В микропробирки по 10.6 вносят по 5 мм3 «ПЦР-смеси-1». полученной по 10.4. наслаивают
сверху по 10 мм3 расплавленного воска так. чтобы он полностью накрыл жидкость. Закрывают
крышки, делают пометки с наименованием используемой пары праймеров. Если воск покрыл
жидкость неровно или образовались пузыри, прогревают пробирки в термостате в течение 1 мин при
температуре 95 °С и охлаждают.
Срок хранения мастермикса «ПЦР смесь-1» под воском при температуре минус 20 °С — не
более шести месяцев.
10.8 Для амплификации в микропробирки по 10.7 на поверхность наносят по 10 мм3 «ПЦР-
смеси-2» по 5.3. при этом она не должна проваливаться под воск и смешиваться с «ПЦР-смесью-1». В
противном случае пробирку считают браком и утилизируют.
При использовании амплификаторов без нагреваемой крышки в микропробирки добавляют по
капле (примерно 25 мм3) вазелинового масла.
Затем в одну микропробирку вносят 10 мм3 Кв. а в остальные — по 10 мм3кДНК анализируемых
проб.
10.9 В двух микропробирках ставят контрольные реакции амплификации по ГОСТ Р 52833:
- отрицательный контроль ПЦР К— вместо ДНК-пробы вносят 10 мм3ДНК-буфера;
• положительный контроль ПЦР К+ — вместо ДНК-пробы вносят 10 мм3 ПКО (2 * 103 геномных
эквивалентов вирусной кДНК в кубических сантиметрах).
10.10 Запускают на амплификаторе программу термоциклирования в соответствии с таблицей 4.
Т а б л и ц а 4 — Программы для амплификации кДНК вирусов НБ. ИБК и ИББ на термоциклерах с активным
регулированием температуры по раствору в пробирке
Наименование
праймеров
Температура. °С
время .с
Числоциклов
95
Пауза
NDF-VNDF-2
95
300
1
95
10
40
60
10
72
10
72
300
1
10
Хранение
11