ГОСТ Р 56144—2014
12.5 Для анализируемых проб, содержащих кДНК вируса, в дорожке должна наблюдаться яркая
светящаяся полоса на уровне, соответствующем ПКО данного вируса.
12.6 Оценивают концентрацию ПЦР-продухта. сравнивая визуально интенсивность свечения
соответствующейемуполосыиполосмаркерамолекулярныхмасс ДНКпо5.3на
электрофореграмме. Испытания (секвенирование ДНК) пробы продолжают при условии, если
свечение полосы ПЦР-продукта той же интенсивности или более интенсивно по отношению к
свечению полос маркера молекулярных масс ДНК.
12.7 В случае, если полоса ПЦР-продукта менее интенсивна по отношению к полосам маркера
молекулярных масс ДНК. то проводят повторное испытание, начиная с этапа выделения РНК.
П р и м е ч а н и е — Низкий уровень или отсутствие амплификации фрагмента генома вируса может
быть в некоторых случаях обусловлено неполным соответствие нуклеотидной последовательности штамма
вируса и используемых ПЦР-праймеров. В подобных случаях рекомендуется разрабатывать специфические
данному штамму вируса праймеры на основании сведений о особенностях его генетической структуры.
13 Секвенирование амплифицированных фрагментов генома
13.1 Очистка ПЦР-продукта
13.1.1 Перед секвенированием амплифицированного фрагмента генома проводят очистку ПЦР-
продукта, полученного в соответствии с разделом 10. от невключившихся праймеров и дНТФ.
13.1.2 Для очистки берут 0.5 — 2.0 мм3 ПЦР-продукта. добавляют 2 мм3 реагента для очистки
продуктов ПЦР по 5.3 и перемешивают пипетированием.
13.1.3 Полученный по 13.1.2 раствор инкубируют при температуре 37 °С в течение 15 мин. Затем
встряхивают и осаждают капли кратковременным центрифугированием и снова инкубируют при
температуре 80 °С в течение 15 мин.
13.2 Проведение секвенирования
13.2.1 Очищенные в соответствии с 13.1 ПЦР-продукты секвенируют с прямого и обратного
праймеров. Для F-гена вируса НБ и S-гена вируса ИБК в реакцию секвенирования берут 20 нг
соответствующего ПЦР-продукта (ДНК); для продуктов амплификации M-гена вируса НБ и VP2 гена
вируса ИБК — 40 нг.
13.2.2 Для проведения реакции в тонкостенные микропробирки вместимостью 0.2 см3 вносят
необходимое количество ДНК по 13.2.1, 0.8 мм3 специфичного праймера молярной концентрации 1
мкмоль/дм3, а также 1 мм3 смеси реагента для секвенирования по 5.3. При этом общий объем
реакционной смеси должен быть 5 мм3.
13.2.3 Термоциклирование проводят на амллификаторах с термостатируемой крышкой,
соблюдая следующий режим.
а) начальная денатурация — 1 мин при температуре 96 X ;
б) затем 25 циклов:
1) денатурация при температуре 96 X — 10 с;
2) отжиг праймера — 5 с;
3) элонгация праймера при температуре 60 °С — 4 мин.
13.2.4 Отжиг в реакции секвенирования проводят при температуре:
- 60 X — для праймеров NDF\. NDR2, NDM2, и NDM4)
- 55 X — для праймеров IBDVVP2-‘\ и IBDV-VP2-2;
- 50 X — для праймеров IBV-S-1 и IBV-S-2.
13.2.5 Полученные после амплификации продукты секвенирования — реакционную смесь
объемом 5 мм3— используют для дальнейшего испытания в соответствии с разделом 14.
14 Определение нуклеотидной последовательности фрагментов геномов
штаммов вирусов методом капиллярного электрофореза
14.1 Подготовка анализируемой пробы с продуктами секвенирования
14.1.1 Проводят очистку реакционной смеси, полученной в соответствии с 13.2, от избытка
дНТФ.флуоресцентно-меченных ддНТФ.секвенирующего праймераи солейосаждением
полинуклеотидов изопропиловым спиртом. Для этого к реакционной смеси объемом 5 мм3 в
15