ГОСТ Р 56144—2014
60 °С на 2 — 3 мин, снова встряхивают, а затем центрифугируют при 12000 — 13000 об./мин на
микроцентрифуге с угловым ротором в течение 1 мин.
8.11Надосадочная жидкость, полученная после центрифугирования по 8.10. содержит очищенную
РНК (РНК-пробу). которую затем используют для реакции ОТ в соответствии с разделом 9.
Срок хранения РНК-лробы при температуре от 2 вС до 8 °С — не более 4 ч.
9 Реакция обратной транскрипции (ОТ)
9.1 Для проведения реакции ОТ используют набор реагентов по 5.3.
9.2 Готовят реакционную смесь. Для этого в микропробирку вместимостью 0,6 см3 вносят 125
мм3 реагента «RT-mix», добавляют 5 мм3реагента «RT G-mix-1» и 6 мм3обратной транскриптазы «М-
MLV». тщательно перемешивают.
9.3 В микропробирки вместимостью 0.6 см3вносят по 10 мм3готовой реакционной смеси по 9.2 и
по 10 мм3 РНКпроб, полученных в соответствии с разделом 8. Осторожно перемешивают
пипетироеанием. Инкубируют пробирки в течение 30 мин в термостате при температуре 37 °С.
Полученный препарат кДНК разводят в два раза ДНКбуфером, аккуратно перемешивают
пипетироеанием.
9.4 Срок хранения готового препарата кДНК при температуре не выше минус 16 °С — не более
семи дней или при температуре не выше минус 68 °С — не более одного года.
10 Амплификация фрагментов генома вирусных штаммов методом ПЦР
10.1Для идентификации штаммов вируса НБ используют две пары праймеров, позволяющих
амллифицировать фрагмент F-гена длиной 442 п. н. и фрагмент M-гена длиной 1051 п. н., в
соответствии с таблицей 1.
Т а б л и ц а 1— Праймеры для идентификации штаммов вируса НБ
Наименование
праймера
Направление
праймера
Нуклеотидная последовательность
Положение
NDF-1
Прямой
S^CTCTTGAtT/CJGGtC’TJAGCG’AjCCTCTtT/CjGC-a’
4635 — 4656
NDF-2
Обратный
5’-GCCACTGCTAGTTG(T/Gl’C)GATAATCC-3’
5076- 5054
NDM-3
Прямой
p
5’-GGAGTGCCC<C/T)(A’G)ATTGTGCCAAGATG-3’
3268 — 3292
NDM-4
Обратный
i
5’-GTGGTC(A
i
G)G<GA)(G’A)GTCAC(T.|,C)GCGAC-3’
4318 — 4298
Указаны позиции первого и последнего нуклеотида соответствующего праймера относительно
последовательности генома вируса НБ с регистрационным номером AY845400 вбазах данных.
10.2Для идентификации штаммов вируса ИБК используют пару праймеров, позволяющую
амллифицировать фрагмент S-гена длиной 467 п. н., в соответствии с таблицей 2.
Т а б л и ц а 2 — Праймеры для идентификации штаммов вируса ИБК
Наименование
праймера
Направление
праймера
Нуклеотидная последовательность
Положение
IBV-S-1
Прямой
5’-ATAATACTGG(C’,T)AA{Ci‘T)TTTTCAGATGG-3’
21071 — 21095
IBV-S-2
Обратный
5’-CTCACCTN(A|T/G)ATAAACACC(C/T)TTAC-3’
21537 — 21515
Указаны позиции первого и последнего нуклеотида соответствующего праймера относительно
последовательности генома вируса ИБК с регистрационным номером FJ904721 в базах данных.
10.3Для идентификации штаммов вируса ИББ используют пару праймеров, позволяющую
амллифицировать фрагмент УР2-гена длиной 743 п. н.. в соответствии с таблицей 3.
10