ГОСТ ISO 21871—2013
Некоторые штаммы презумптивныхбактерий Bacilluscereusобладаютслабой реакциейна яичный
желток или не обладают никакой реакцией. В подобных случаях ивдругих сомнительных случаях такие
колонии подлежатдополнительной проверке.
9.1.5 Подтверждение
9.1.5.1 Общие положения
Типичные колонии (9.1.4.2) и атипичные колонии (9.1.4.3) на PEMBA или МУР должны быть
подтверждены посредством испытания с помощью гемолиза на агаре с бараньей кровью. В качестве
альтернативы типичные колонии на среде PEMBA или среде МУР проверяют с использованием мик
роскопа.
9.1.5.2 Отбор и очистка колоний для подтверждения
Отбирают по три колонии с каждой чашки Петри, выбранные по 9.1.4. Если на поверхности агара
находится менее трех колоний, отбирают все имеющиеся колонии. Данные колонии проверяются по
9.1.5.ЗилиЭ.1.5.4.
Если на чашках Петри получен сплошной рост микроорганизмов по линии пересева, то отбирают
посевной материал из трехточек этого пересева ипроводят посев надругие чашки Петри, содержащие
твердую селективную среду (5.4 или 5.5).Эффективней предварительно перед посевом отобранный
материал развести. Если слои переполнены колониями инет возможности отобрать четко изолирован
ные колонии, отбирают материал колоний из трехточек и производят посев на слоях, содержащих твер
дую селективную среду (5.4 или 5.5). Инкубируют втермостате (6.3) при температуре 37 °С (PEMBA) или
при 30 °С(МУР)от 18до 24 ч.Отбираютс каждого слоя поменьшей мереоднучетко изолированную коло
нию. Подтверждаютэти колонии, как это указано в9.1.5.3 или 9.1.5.4.
9.1.5.3 Подтверждение тестом на гемолитическую активность на агаре с бараньей кровью (МУР
или PEMBA)
Проводят посев отобранных (9.1.4.2 или 9.1.4.3)с МУР или PEMBA колоний на поверхность агара с
бараньей кровью (5.7) таким образом, чтобы получить рост изолированных колоний идать возможность
четко разделенным колониям развиваться.
Инкубируют при температуре 30 °С втечение 24 ч ификсируют реакцию гемолиза.
Каждая колония, окруженная зоной просветления, рассматривается как гемолиз-положительная.
9.1.5.4 Подтверждение с использованием микроскопа (PEMBA)
9.1.5.4.1 Окрашивание
Переносят часть материала из центра колонии вслучае, если возраст культуры составляет 24 ч,
или с периферии, если культуры более старые; переносят, используя петлю для посева (6.5). наобезжи
ренное предметноестекло (6.12) ирастираютвмалой капле воды. Высушивают на воздухе ификсируют
путем нагрева. Затем окрашивают споры над кипящей водой раствором малахитового зеленого (5.6.1)
или нагревают втечение одной минутыдо появления паров жидкости. Черездве минуты смывают избы
ток красителя водой, высушивают предметное стекло и покрывают его слоем раствора Судана черно го
В (5.6.2) для окрашивания внутриклеточного жира. Процедуру проводят 15 мин. затем промывают
ксилолом (5.6.3). высушивают при помощи фильтровальной бумаги (6.13) и окрашивают снова раство
ром сафранина (5.6.4)для окрашивания спорангий ивегетативных клетокспор. Через 20 ссливают избы
ток красителя, промывают водой исушат на воздухе.
9.1.5.4.2 Исследование с помощью микроскопа
Окрашенный препарат на предметном стекле. Предметное стекло исследуют под микроско
пом (6.11). используя иммерсионноемасло. Клетки презумптивных бактерий Bacilluscereusвформе кир
пичиков располагаются цепочками и имеют длину от 4 до 5 мкм, ширину — от 1 до 1.5 мкм и содержат
довольно большие количества внутриклеточного жира, который окрашен вчерный цвет. Окрашенные
в
зеленый цвет споры могут бытьвцентре или почти вконце, ноони никогда не раздувают спорангии, окра
шенные в красный цвет.
9.2Метод определения
9.2.1 Анализируемые пробы и исходную суспензию готовят по ISO 6887 взависимости от конкрет
ного продукта или ISO 8261.
9.2.2 Посев и инкубирование
1 см3исходной суспензии добавляют к 9 см3TSPB (5.3) нормальной концентрации (т. е. 0.1 г или
0.1 см3пробы) или 10 см3исходной суспензии к 10 см3TSPB (5.3)двойной концентрации (т.е. 1гили 1см3
пробы). Для больших объемов анализируемые пробы готовят исходную суспензию добавлением х см3
или х г к9х см3разбавителя (см. соответствующую часть ISO 6887 или ISO 8261). затем добавляют все
количество исходной суспензии к 90х см3TSPB (5.3) нормальной концентрации (например, добавляют
9