ГОСТ Р 51196—2010
рыв добавляют одновременно, но в указанной последовательности для проведения следующих
реакций:
a) для окисления L- и D-молочной кислоты. L- и D-лактата в присутствии никотинамидаденинди-
нуклеотида (НАД*)до пирувата и преобразования НАД* в восстановленную форму НАДН — L-лактатде-
гидрогеиазу (L-ЛДГ) и D-лактатдегидрогеназу (D-ЛДГ):
b
) для преобразования в присутствии L-глутамата пирувата в L-аланин и L-глутамата в а-кетоглу-
тарат — глутамат-пируват-трансаминазу (ГПТ).
Количество образовавшегося НАДН. которое пропорционально содержанию L- и D-молочной кис
лоты и L- и D-лактатов, определяют спектрофотометрически измерением оптической плотности инкуба
ционной смеси при длине волны 340 нм.
5 Реактивы
Используют реактивы только установленнойаналитическойстепени чистоты. Вода, используемая
для приготовления растворов ферментов, должна быть бидистиллированной. полученной на стеклян
ном оборудовании, а вода, используемая для других целей, должна быть дистиллированной.
5.1 Раствор калия гексацианоферрата(Н), с (K«[Fe(CN)c] ЗН20) = 35.9 г/дм3
Растворяют в воде 35,9 г тригидрата калия гексацианоферрата(П). Разбавляют водойдо 1000 см3
и перемешивают.
5.2 Раствор цинка сульфата, с (ZnS04 7Н20) = 71,8 г/дм1
Растворяют в воде 71,8 г гептагидрата сульфата цинка. Разбавляют водой до 1000 см3и переме
шивают.
5.3 Растворы натрия гидроксида
5.3.1 Раствор I натрия гидроксида, с (NaOH) = 10 моль/дм3
Растворяют в водо 400 г натрия гидроксида. Разбавляют водой до 1000 см3и перемешивают.
5.3.2 Раствор II натрия гидроксида, с (NaOH) = 0,1 моль/дм3
Растворяют 4,0 г натрия гидроксида в воде. Разбавляют водой до 1000 см3и перемешивают.
5.4 Раствор глицерина (С3На0 3). с объемной долей глицерина 50 %.
5.5 Раствор аммония сульфата, с [(NH4)2S04] = 3,2 моль/дм3
Растворяют 422.84 г аммония сульфата в воде. Разбавляют водой до 1000 см3и перемешивают.
5.6 Буферный раствор, pH 10
Растворяют 7,92 г глицилглицина (C4HaN20 3) и 1,47 г L-глутаминовой кислоты (C5H5N04) в 80 см3
воды. Устанавливают pH (10,0 ± 0,1) при 20 °С раствором I гидроксида натрия (см. 5.3.1) и при постоян ном
перемешивании доводят объем раствора водой до 100 см3.
Раствор хранят не более 3 мес при температуре от 0 °Сдо 5 °С.
5.7 Раствор никотинамид-аденин-динуклеотида (НАД)
Растворяют 350 мг никотииамид-аденин-динуклеотида (C2,H27NT0 14P2) в 10 см3воды.
Полученный раствор хранят в течение 1 мес при температуре от 0 СС до 5 °С. Во время использо
вания сосуд с раствором должен быть погружен в емкость с дробленым льдом.
5.8 L-лактатдегидрогоназа (L-ЛДГ), из суспензии мышцы свиньи
10 мг суспензии L-лактатдегидрогеиазы растворяют в 1см3 раствора глицерина (5.4). pH получен
ной суспензии должен быть около 7. Если удельная активность L-ЛДГ менее 5500 ед./см3, проводят по
вторное приготовление раствора фермента согласно вышеприведенным указаниям.
Раствор L-ЛДГ стабилен в течение 12 мес при хранении при температуре от 0 “С до 5 °С.
Во время использования раствора L-ЛДГ согласно разделу 8 емкость с ферментом охлаждают и
выдерживают в ледяной бане.
5.9 D (D-ЛДГ) (из культуральной жидкости Lactobacillus leichmannii)
5 мг суспензии D-ЛДГ растворяют в 1см3раствора сульфата аммония (см. 5.5) pH полученной сус
пензиидолжен бытьоколо6. Удельная активность D-ЛДГ должна бытьне менее 1500 ед./см3при25 °С.
Если это не так, приготовляют другую суспензию D-ЛДГ.
Суспензия D-ЛДГ стабильна в течение 12 мес при хранении при температуре от 0 °С до 5 °С.
Во время использования раствора L-ЛДГ согласно разделу 8 емкость с ферментом охлаждают и
выдерживают в ледяной бане.
2