ГОСТ 33505—2015
Анализ результатов ПЦР осуществляют с применением горизонтального электрофореза в 2%-ном
агарозном геле. При положительном анализе обнаруживают ампликоны молекулярной массой 243 п.н.
для пары праймеров Р1/Р2 или 220 п.н. для пары праймеров 3’ NCR sense/3’ NCR antisense.
Электрофорез продуктов амплификации
При электрофорезе продуктов амплификации готовят 2%-ный агарозный гель в буферном рас
творе 0,5х ТАЕ по 7.1.3.2. Наносят капли загрузочного буферного раствора по 7.1.3.3 объемом 3 мм3 на
пленку Парафилм, добавляют к капле 20 мм3 продукта амплификации и тщательно перемешивают, вносят
продукты амплификации, включая положительный и отрицательный контроли, в лунки геля. В первую
лунку геля вносят ДНК-маркер с молекулярной массой 100 п.н.
Проводят электрофорез в течение 20 мин при напряжении 120 В (для геля 15 * 10 см) или в тече
ние 40 мин при напряжении 160 В (для геля 15 * 25 см) в буферном растворе 0,5х ТАЕ. Погружают гель
в раствор бромистого этидия по 7.1.3.4 на 20 мин. Просматривают гель на ультрафиолетовом транс
иллюминаторе.
8.4.3.2 Иммуноспецифическая ПЦР с ОТ
Вносят иммуноглобулины в пробирки типа Эппендорф вместимостью 0,5 см3. Для этого гото
вят рекомендуемое разведение специфичных поликлональных антител или моноклональных антител
5B-IVIA в карбонатном буферном растворе pH 9,6.
Вносят по 100 мм3 раствора антител в каждую пробирку типа Эппендорф. Инкубируют в термо
стате 3 ч при температуре 37 °С. Дважды промывают пробирки, используя 150 мм3 промывочного бу
ферного раствора.
Готовят растительный экстракт с использованием экстрагирующего буферного раствора, осветля
ют 100 мм3 растительного экстракта центрифугированием (в течение 5 мин при скорости 2000 об/мин) и
вносят в пробирки типа Эппендорф с адсорбированными антителами, инкубируют пробирки в течение
2 ч на льду или в термостате при температуре 37 °С. Пробирки трижды промывают, используя 150
мм3 промывочного буферного раствора.
Проводят ОТ в соответствии с термоциклическими условиями, приведенными в таблице 3.
Готовят реакционную смесь для ПЦР в соответствии с 8.4.2.2 и вносят ее в пробирки с нанесен
ными антителами. ПЦР и анализ результатов проводят в соответствии с 8.4.3.1.
8.4.3.3 ПЦР с ОТ в режиме реального времени
ПЦР с ОТ в режиме реального времени на выявление потивируса шарки слив проводят с исполь
зованием соответствующих наборов реагентов в соответствии с инструкциями изготовителей.
8.4.3.4 ПЦР с ОТ в формате FLASH
ПЦР с ОТ в формате FLASH на выявление потивируса шарки слив проводят с использованием
соответствующих наборов реагентов в соответствии с инструкциями изготовителей.
8.4.4 Проведение исследования для идентификации штаммов потивируса шарки слив
Идентификацию штаммов PPV-D, PPV-M, PPV-Rec, PPV-C, PPV-CR и PPV-W потивируса шарки
слив проводят методом ПЦР с ОТ.
8.4.4.1 Идентификация штаммов PPV-D и PPV-M
Для специфического выявления штамма PPV-D используют пару праймеров P1/PD (см. 6.5).
Для специфического выявления штамма PPV-M используют пару праймеров Р1/РМ (см. 6.5).
Проводят ОТ в соответствии с термоциклическими условиями, приведенными в таблице 3.
Реакционную смесь для ПЦР готовят в соответствии с 8.4.2.2.
ПЦР проводят на амплификаторе при термоциклических условиях, указанных в таблице 6.
Таблица 6 — Термоциклические условия для ПЦР с ОТ с праймерами P1/PD и Р1/РМ
Температура,
°С
Время
Число циклов
95
15 мин
1
35
95
60
72
30 с
30 с
1 мин
72
10 мин
1
4
Хранение
—
17