ГОСТ 33505—2015
8.3 Серологические методы выявления и идентификации
8.3.1 Сущность методов
Серологические методы исследования потивируса шарки слив представлены твердофазным ИФА
в модификациях DAS-ELISAn TAS-ELISA.
Сущность методов ИФА заключается в выявлении в образце иммунного комплекса «антиген—ан
титело» к потивирусу шарки слив путем присоединения к одному из компонентов реакции ферментатив
ной метки с последующей ее детекцией в сравнении с положительными и отрицательными контролями.
8.3.2 Подготовка проб
Исследуемый образец растения, отобранный по 7.2.1, массой 1 г гомогенизируют в пластико
вом контейнере с 20 см3 экстрагирующего буферного раствора по 7.1.1.3 на гомогенизаторе в течение
2—5 мин или с помощью фарфоровой ступки и пестика до получения однородной суспензии и
осветляют центрифугированием в течение 5 мин при скорости 2000 об/мин с охлаждением до
температуры 5 °С.
8.3.3 Проведение исследования
8.3.3.1 Твердофазный ИФА в модификации DAS-ELISA
Твердофазный ИФА в модификации DAS-ELISA на выявление потивируса шарки слив (в том чис
ле с использованием тест-системы биотин/стрептавидин) проводят с использованием тест-систем и
специфических моноклональных антител 5B-IVIA или поликлональных антител для универсального вы
явления всех изолятов потивируса шарки слив в соответствии с инструкциями изготовителей.
Готовят рекомендуемое разведение кроличьих поликлональных антител или моноклональных
антител 5B-IVIA в карбонатном буферном растворе по 7.1.2.2 и вносят по 200 мм3 в каждую лунку план
шета, используя дозаторы со сменными одноразовыми наконечниками.
Планшет закрывают и инкубируют в термостатируемом встряхивателе при температуре 37 °С в
течение 4 ч или при температуре 4 °С в течение 16 ч и трижды промывают лунки планшета промывоч ным
буферным раствором по 7.1.1.2.
Вносят в каждую лунку планшета по 200 мм3 пробы растительного экстракта, полученной по 8.3.2.
Используют по две лунки для каждого образца и для положительного контроля и не менее двух лунок для
отрицательного контроля. Лунки маркируют.
Планшет закрывают и инкубируют в холодильной камере при температуре 4 °С в течение 16 ч и
трижды промывают лунки планшета промывочным буферным раствором.
Для универсального выявления всех изолятов потивируса шарки слив готовят рекомендуемое
разведение конъюгата в буферном растворе для конъюгата по 7.1.2.4.
Вносят в каждую лунку планшета по 200 мм3поликлональных антител или моноклональных анти
тел 5B-IVIA, конъюгированных с щелочной фосфатазой или биотином.
Планшет закрывают и инкубируют в термостатируемом встряхивателе при температуре 37 °С в
течение 2—4 ч в зависимости от рекомендаций изготовителя тест-системы и трижды промывают лунки
планшета промывочным буферным раствором.
В случае если антитела мечены биотином, используют рекомендуемые разведения стрептави-
дин-щелочнофосфатазного конъюгата. Вносят по 200 мм3 в каждую лунку планшета.
Планшет закрывают и инкубируют в термостатируемом встряхивателе при температуре 37 °С в
течение 30 мин и трижды промывают лунки планшета промывочным буферным раствором.
Для обеих тест-систем (традиционной системы и системы биотин/стрепта-видин) готовят раствор
субстрата для щелочной фосфатазы (1 мг р-нитрофенил-фосфата на 1 см3 субстратного буферного
раствора по 7.1.2.5) и вносят по 200 мм3 в каждую лунку планшета.
Планшет закрывают и инкубируют при температуре от 18 °С до 25 °С, затем считывают показа
ния на иммуноферментном фотометрическом анализаторе при длине волны 405 нм через 30, 60, 90 и
120 мин.
8.3.3.2 Твердофазный ИФА в модификации TAS-ELISA
Твердофазный ИФА в модификации TAS-ELISA на выявление потивируса шарки слив проводят с
использованием тест-систем и специфических моноклональных антител 5E3-IVIA для универсального
выявления всех изолятов потивируса шарки слив в соответствии с инструкциями изготовителей.
Характеризацию и типизацию штаммов PPV-D, PPV-M, PPV-C и PPV-EA осуществляют с исполь
зованием специфических моноклональных антител, специфичных к этим штаммам.
Готовят рекомендуемое разведение кроличьих поликлональных иммуноглобулинов к потивирусу
шарки слив в карбонатном буферном растворе по 7.1.2.2 и вносят по 200 мм3 в каждую лунку планшета,
используя дозаторы со сменными одноразовыми наконечниками.
14