ГОСТ 33505—2015
Планшет закрывают и инкубируют в термостатируемом встряхивателе при температуре 37 °С в
течение 4 ч или при температуре 4 °С в течение 16 ч и трижды промывают лунки планшета промывоч ным
буферным раствором по 7.1.1.2.
Вносят в каждую лунку планшета по 200 мм3 пробы растительного экстракта, полученной по 8.3.2.
Используют по две лунки для каждого образца и для положительного контроля и не менее двух лунок для
отрицательного контроля. Лунки маркируют.
Планшет закрывают и инкубируют в холодильной камере при температуре 4 °С в течение 16 ч и
трижды промывают лунки планшета промывочным буферным раствором.
Для универсального выявления всех изолятов потивируса шарки слив готовят рекомендуемые
разведения моноклональных антител 5B-IVIA в буферном растворе для конъюгата по 7.1.2.4 и вносят по
200 мм3 раствора антител в каждую лунку планшета.
Для специфического выявления штамма PPV-D с использованием моноклональных антител 4D,
штамма PPV-M с использованием моноклональных антител AL, штамма PPV-C с использованием моно
клональных антител Ас, штамма PPV-EA с использованием моноклональных антител ЕА готовят реко
мендуемые разведения соответствующих моноклональных антител в буферном растворе для конъюга та
и вносят по 200 мм3 раствора антител в каждую лунку планшета.
Планшет закрывают и инкубируют в термостатируемом встряхивателе при температуре 37 °С в
течение 2 ч и трижды промывают лунки планшета промывочным буферным раствором.
Вносят в лунки планшета антимышиные иммуноглобулины, конъюгированные с щелочной фосфа
тазой, готовят рекомендуемое разведение конъюгата в буферном растворе для конъюгата. Вносят по
200 мм3 в каждую лунку планшета.
Планшет закрывают и инкубируют в термостатируемом встряхивателе при температуре 37 °С в
течение 2 ч и трижды промывают лунки планшета промывочным буферным раствором.
Готовят раствор субстрата для щелочной фосфатазы (1 мг р-нитрофенил-фосфата на 1 см3суб
стратного буферного раствора по 7.1.2.5).
Планшет закрывают и инкубируют при температуре от 18 °С до 25 °С, затем считывают показа
ния на иммуноферментном фотометрическом анализаторе при длине волны 405 нм через 30, 60, 90 и
120 мин.
8.3.4 Обработка результатов
Результат исследования считают отрицательным, если значение абсорбции образца не более
двукратного значения абсорбции в отрицательном контроле.
8.4 Молекулярные методы выявления и идентификации
8.4.1 Сущность методов
Сущность молекулярных методов исследования потивируса шарки слив заключается в выявле
нии вируса в образце путем многократного избирательного копирования определенного участка ну
клеиновой кислоты при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro) в целях обнаружения
чужеродной для образца РНК вируса.
8.4.2 Подготовка к исследованию
8.4.2.1 Для ОТ рекомендуется использовать готовые наборы реагентов (мастер-миксы). Приготов
ление реакционных смесей осуществляют с помощью микроцентрифуги-встряхивателя в соответствии с
инструкциями изготовителей.
8.4.2.2 Для ПЦР рекомендуется использовать готовые наборы реагентов (мастер-миксы). При
готовление реакционных смесей осуществляют с помощью микроцентрифуги-встряхивателя в соответ
ствии с инструкциями изготовителей.
8.4.2.3 Подготовка проб
При проведении классической ПЦР с ОТ, ПЦР с ОТ в формате FLASH и ПЦР с ОТ в режиме ре
ального времени из исследуемого образца растения, отобранного по 7.2.1, проводят выделение РНК с
использованием наборов реагентов для выделения нуклеиновых кислот в соответствии с инструкциями
изготовителей.
При проведении иммуноспецифической ПЦР с ОТ исследуемый образец растения, отобранный
по 7.2.1, массой 1 г гомогенизируют в пластиковом контейнере с 20 см3 экстрагирующего буферного
раствора по 7.1.1.3 (вариант 1) на гомогенизаторе в течение 2—5 мин или с помощью фарфоровой
ступки и пестика до получения однородной суспензии.
15