ГОСТ 33505—2015
8.4.3Проведение исследования для универсального выявления всех изолятов потивируса
шарки слив
8.4.3.1 ПЦР с ОТ
Для универсального выявления всех изолятов потивируса шарки слив используют пару прайме
ров Р1/Р2 или пару праймеров 3’ NCR sense/3’ NCR antisense (см. 6.5).
Реакцию ОТ проводят при термоциклических условиях, указанных в таблице 3.
Таблица 3 — Термоциклические условия для проведения реакции ОТ
Первый этап ОТ
Реакция ОТРежим ОТ
Вода стерильная
При температуре 4 °С
в течение 5 мин
ПраймерыRandom dN10
3 мм3
При температуре 70 °С
0,5 мм3
в течение 5 мин
Oligo dT17
0,5 мм3
РНК
5 мм3
Второй этап ОТ
Вода стерильная1 мм3
При температуре 40 °С
в течение 60 мин
При температуре 70 °С
в течение 10 мин
5х буферный раствор для синтеза первой цепи кДНК4 мм3
dNTPs2 мм3
ДТТ2 мм3
Ревертаза MMLV2 мм3
Примечание — При использовании наборов реагентов с модифицированной ревертазой MMLV или ре-
вертазой AMV термоциклические условия реакции корректируют в соответствии с инструкциями изготовителей.
ПЦР проводят на амплификаторе при термоциклических условиях, указанных в таблицах 4 и 5.
Таблица 4 — Термоциклические условия для ПЦР с ОТ с праймерами Р1/Р2
Температура, °С
Время
Число
ЦИКЛОВ
95
15 мин
1
35
95
60
72
30 с
30 с
1 мин
72
10 мин
1
4
Хранение
—
Таблица 5 — Термоциклические условия для ПЦР с ОТ с праймерами 3’ NCR sense/3’ NCR antisense
Температура, °С
Время
Число циклов
95
15 мин
1
35
95
61
72
30 с
30 с
1 мин
72
10 мин
1
4
Хранение
—
Примечание — При использовании комплектов реагентов с другими типами Taq-полимеразы термоци
клические условия корректируют в соответствии с инструкциями изготовителей.
16