ГОСТ ISO 10993-5—2011
5.4 Для исследования используют лишь клетки, не содержащие микоплазму.
Перед использованием маточные культуры исследуют надежным методом, чтобы убедиться в
отсутствии микоплазмы.
6 Культуральная среда
6.1 Культуральная средадолжна бытьстерильной.
6.2 Культуральнаясреда ссывороткой илибез нее должна соответствоватьусловиям, требовани
ям роста или поддержанияжизнеспособности определенной линии клеток.
П р и м е ч а н и е — Можно включить в состав среды антибиотики, убедившись, что они не оказывают
неблагоприятного воздействия на пробы.
Стабильность культуральной среды может различаться в зависимости от композиции и условий
хранения. Среду, содержащую сыворотку и глютамин, хранят при температуре от 2 °С до 8 °С не более
7сут. Средубез сыворотки, содержащую глютамин, хранятпри температуреот2 °Сдо8®Снеболеедвух
недель.
6.3 pH культуральных сред поддерживают на уровнях 7.2 и 7.4.
7 Приготовление маточной клеточной культуры
7.1 Используя выбранную линию и культуральную среду, готовят достаточное число клеток для
проведения исследования. Есликлеткидолжны бытьвыращены изкультур, взятых изхранилища, необ
ходимо удалить криопротектор при его наличии. Перед использованием клеточную культуру пересева
ют хотя бы один раз.
7.2 Клетки удаляют и вновь приводят во взвешенное состояние путем ферментной и/или механи
ческойдезагрегации, используя наиболее подходящий методдля клеток каждойлинии.
8 Методы исследования
8.1 Числодублей
Для исследуемыхпроб иконтроля необходимо использовать не менее трехдублей.
8.2 Испытание экстрактов
8.2.1 Это испытание позволяет оценить цитотоксичность качественно и количественно.
8.2.2 Определенное количество постоянно перемешиваемой клеточной суспензии капают в каж
дыйиздостаточногочисласосудовдляэкспонированиясэкстрактом. Равномернораспределяютклетки
по поверхности каждогососуда легким вращением.
8.2.3 Культуры инкубируют при (37 ± 2) °С в воздухе в присутствии 5 % (доля объема) двуокиси
углерода или без нее в соответствии с выбраннойдля культуральной среды буферной системой.
Исследование можно осуществлять на субконфлюэнтном монослое, клетки которого прикрепля
ются к какому-либо твердому субстрату, или на свежесуспендированныхклетках.
При оценкеобразования колонийследуетиспользоватьсоответственнонизкуюплотностьклеток.
8.2.4 Перед началом исследования субконфлуэнтность и морфологию культур проверяют с
помощью микроскопа.
8.2.5 Проводятисследование:
a) на исходном экстракте и
b
) серии разведений экстрактов, используя как разбавитель культуральную среду.
Если в исследовании используют монослой, то культуральную среду следуетудалить и добавить
кратное количествоэкстракта или его разведения в каждый из сосудов.
Если в исследовании используют суспензионные клетки, то добавляют экстракт или его разведе
ние в каждый издублирующих сосудовсразу же после приготовления клеточной суспензии.
8.2.6 Когда используютне изотоническийэкстракт, например воду, испытываютэкстракт при наи
более физиологически совместимой концентрации после разведения в культуральнойсреде.
П р и м е ч а н и е — Рекомендуется использовать концентрированную культуральную среду, например 2х,
5х. для разведения водных экстрактов.
8.2.7 Добавляют определенное количество пустого реактива, отрицательного и положительного
контрольных образцов в дополнительныедублирующие сосуды.
4