ГОСТ ISO 10993-5—2011
Всеабсорбирующие материалы до помещения наагарследует предварительно поместить в куль
туральную среду во избежаниедегидратации агара.
8.4.1.7 Готовят дублирующие сосуды с обоими препаратами отрицательного и положительного
контрольныхобразцов.
8.4.1.8 Сосуды инкубируют в условияхописанных в 8.4.1.3. от 24 до 72 ч.
8.4.1.9 Осматривают клетки для определения цитотоксичностидо и после осторожного удаления
образцов с поверхности агара. Использование витальной окраски, например, нейтрального красного,
может способствовать обнаружению цитотоксичности. Витальный краситель можно добавлять до или
после инкубации с образцом. Если краситель добавлен перед инкубацией, то культуры защищают от
воздействия света во избежание повреждения клеток вследствие фотоактивации витального
красителя.
8.4.2Испытание методом диффузии нафильтре
8.4.2.1 Это исследование используютдля качественной оценки цитотоксичности.
8.4.2.2 Свободный от поверхностно-активных веществ фильтр с размером пор 0.45 мкм помеща
ют в каждый сосуд идобавляют определенное количество постоянно перемешиваемой клеточной сус
пензии в каждый издостаточного числа дублирующихсосудовдля испытания. Осторожным вращением
клетки равномерно распределяютпо поверхности каждогофильтра.
8.4.2.3 Культуры инкубируют при (37 ♦ 2) °С в воздухе в присутствии 5 % (доля объема)двуокиси
углерода или без нее в соответствии с выбраннойдля культуральной среды буферной системой до тех
пор. пока культуры не вырастутприблизительнодо конфлуэнтностив концелогарифмическойфазы кри
вой роста.
8.4.2.4 Перед началом исследования субконфлуэнтность и морфологию культур проверяют с
помощью микроскопа.
8.4.2.5 Удаляют из сосудов культуральную среду. Затем фильтр стороной, на которой находятся
клетки, помещают на слой застывшегоагара (см. 8.4.1.6).
8.4 2.6 Осторожно помещают дублирующие исследуемые образцы на верхнюю (без клеток) сто
ронуфильтра. Жидкие экстракты исвежесмешанные смеси помещают на фильтр.
8.4.2.7Готовят дублирующие фильтры с препаратами отрицательного и положительного кон
трольных образцов.
8.4 2.8 Сосуды инкубируют в условиях, описанных в 8.4.2.3. втечение 2ч • 10 мин.
8.4 2.9 Осторожно удаляютобразцы сфильтра иотделяют фильтр от поверхности агара.
8.4.2.10 Определяют цитотоксичность, используя соответствующую методикуокрашивания.
8.5 Определение цитотоксичности
8.5.1Определяют цитотоксичность методом качественной или количественной оценки.
а) Качественнаяоценка, осматривают клеткичерез микроскоп, прижелании, используя цитохими
ческую окраску, чтобы оценить изменения, например, изменение общей морфологии, вакуолизацию,
расщепление, лизис клетоки целостность мембран. Отклонение от нормальной морфологии регистри
руют в отчетеоб исследовании описательно или цифрами. Втаблице приведенудобный способ оценки
испытуемых материалов.
Т а б л и ц а 1
Шкала цитотоксичности
Интерпретация
0
Не цитотоксичный
1
Легкая цитотоксичность
2
Средняя цитотоксичность
3
Значительная цитотоксичность
Описывают метод оценки в отчете. Метод и результаты оценкидолжны быть включены в отчетоб
исследовании.
Ь) Количественная оценка: измеряютчисло погибших клеток, замедление роста клеток, пролифе
рацию клеток или образование колоний. Число клеток, количество белка, высвобождение ферментов,
высвобождение или сокращение витальной окраски или другой измеримый параметр могут быть коли
чественнооценены с помощьюобъективных средств. Объективные средства ирезультатрегистрируют в
отчете об исследовании.
6