ГОСТ РИСО 17853—2012
q)Промывают осадок в 1мл 50 мМ Трис-буфере (см. 3.2.14) (pH 7.6). Центрифугируют пробирки
при 16000 д в течение 10 мин. Аккуратноудаляютжидкостьс помощью микропипетки, не затрагивая оса
док на дне пробирок.
г) Повторяют действия по перечислению q) еще раз.
s) Ресуспендируют осадок в 1 мл 50 мМ Трис-буфере и обрабатывают ультразвуком в течение
30 с, используя ультразвуковой дезинтегратор клеток, оснащенный титановым микрозондом, либо в об
рабатываемой ультразвуком водяной бане в течение 30 мин.
Следует обратить внимание, что использование ультразвуковогодезинтегратора клеток является
более эффективным, однако для предотвращения возможной контаминации титаном из наконечника
зонда следует использовать дезинтегратор с чистым и неповрежденным/некорродированным
наконечником.
t) Добавляют протеиназу К (см. 3.2.9) (2 г/мл Трис-буфера) и инкубируют в течение24 ч при темпе
ратуре 55 °С на водяной бане с перемешиванием.
и) Центрифугируют пробирки при 16000 д в течение 15 мин.
v) Аккуратноудаляютжидкостьс помощью микропипетки, не затрагивая осадок надне пробирок.
w) Добавляют 1 мл SDS (2.5 г/100 мл дистиллированной воды).
x) Кипятят
в
течение 10 мин.
y) Охлаждают при комнатной температуре в течение 10 мин.
2
) Центрифугируют пробирки при 16000 д в течение 15 мин.
аа) Аккуратноудаляютжидкостьс помощью микропипетки, не затрагивая осадок надне пробирок.
bb) Промывают осадок в 1мл 50 мМ Трис-буфере (pH 7,6). Центрифугируютпробирки при 16000 д
в течение 15 мин. Аккуратно удаляют жидкость с помощью микропипетки, не затрагивая осадок на дне
пробирок.
сс) Промывают 0.5 мл 80 %-ногоацетона, содержащего3 % SDS (см. 3.2.11) (3 г/100 мл раствора в
80 %-ном ацетоне). Центрифугируют при 16000 д в течение 15 мин. аккуратно удаляют жидкость с по
мощью микропипетки, не затрагивая осадок на дне пробирок.
dd) Промывают 1 мл дистиллированной воды. Центрифугируют пробирки при 16000 д в течение
15 мин. аккуратно удаляют жидкость с помощью микропипетки, не затрагивая осадок на дне пробирок.
ее) Добавляют абсолютный этанол (см. 3.2.1) и хранят при температуре 4 °С в процессе накопле
ния частиц (см. 4.4.2).
П р и м е ч а н и е 3 — В качестве варианта перечисления д)—i) можно выполнить, используя 50 мМ
Трис-буфера. Необходимо проверить эффективность используемого фермента папаина.
4.4 Сбор частиц
4.4.1 Полиэтиленовые частицы
Собирают частицы, отфильтровав сначала на фильтре размерами пор 0,1 мкм. а затем — на фи
льтре размерами пор 0,015 мкм либо аналогичном. Для частиц, выделенных высокоскоростным центри
фугированием. либо для тех случаев, когда необходим полный объем износа, фильтруют весь объем
образца, полученного по 4.2.2.2. используя вакуумную систему фильтрации. Для частиц, выделенных
ультрацентрифугированием (см. 4.2.2.3), используют аликвоты суспензий частиц объемом от 10 до 300
мкл либо большие объемы разбавленной суспензии частиц.
П р и м е ч а н и е — Соответствующее разведение достигается, когда суспензия оказывается почти про
зрачной, обычно при разбавлении от 1:10 до 1:100. Целью данной процедуры является получение такой концентра
ции частиц на фильтре, которая не мешает визуализации отдельных частиц с помощью СЭМ. при том. что для
анализа доступно достаточное число частиц (минимум 100 частиц).
При разбавлении следует указать точное разбавление каждого образца. Для фильтрования отби
рают известный объем суспензии частиц в шприц (см. 3.3.17) и подсоединяют конец шприца к системе
фильтрации (см. 3.3.7). Аккуратно надавливают на поршень шприца, чтобы протолкнуть воду через
фильтр и вытолкнуть из системы фильтрации со скоростью приблизительноодна капля (0.045 мл) в
се кунду. при этом частицы задерживаются на поверхности фильтра. Меняют фильтр в случае
засорения. Используют следующую процедурудля каждого фильтра. Промывают фильтр и
шприцдистиллирован ной водой. Наконец, перед удалением фильтра из системы фильтрации
продувают фильтр воздухом в направлении фильтрации, используя пинцет, а затем оставляют
высохнуть в стерильной закрытой чашке Петри.
5