ГОСТ РИСО 17853—2012
5.2.6 Идентификация частиц
1
Идентификация частиц должна быть проведена с помощью инфракрасной слеароскопии с
Фурье-преобразованием (ИКФП). как описано в 4.6.1.
5.3 Методика для металлических частиц
5.3.1 Общие сведения
Из-за растворения металлов в сильных кислотах и щелочах необходимо использовать методы
ферментативного гидролиза. Метод, описанный в 5.3.2. ранее был опубликован в [6]. Авторами были
сделаны некоторые незначительные изменения по сравнению с ранее разработанной процедурой [11]с
целью использования больших объемов сыворотки, содержащей большее количество органических
загрязнителей.
Методика идентична описанной для выделения и анализа частиц из тканей [5] (см. раздел 4) с не
значительными различиями на начальных этапах, а также различиями в концентрации фермента с уче
том использования сывороточного лубриканта вместо образцов ткани.
П р и м е ч а н и е 1 — Возможность использования одинаковой процедуры для выделения и анализа час
тиц из тканей и лубриканта для симулятора сустава позволяет проводить прямое и точное сравнение выделенных
частиц (7J. что важно, например, для валидации симулятора сустава. Это значительное преимущество данной про
цедуры.
П р и м е ч а н и е 2 — Методика, описанная в 5.3.2. изначально была разработана для изоляции частиц из
95 %-ного сывороточного лубриканта. Поэтому ее можно использовать для выделения частиц из жидкостей с очень
высоким содержанием белка.
П р и м е ч а н и е 3 — Данная методика, безусловно, может быть адаптирована для выделения и характе
ристики частиц из биологических жидкостей человека (например, синовиальной жидкости) благодаря нескольким
этапам гидролиза для органических компонентов различных типов.
5.3.2 Гидролиз сыворотки
a) Центрифугируют образец сыворотки объемом 15 мл при 16000 д в течение 10 мин в стеклянных
пробирках объемом 25 мл (стеклянные пробирки являются более предпочтительными для предотвра
щения прилипания частиц к стенкам пробирки).
П р и м е ч а н и е 1 — Необходимый объем сыворотки зависит от суммарного объема износа имплантата,
подвергнутого циклическому испытанию в симуляторе. Образец сыворотки объемом 15 мл из объема сыворотки
100 мл. содержащей частицы износа общим объемом приблизительно от 0,4 до 0.8 мм3, дает видимый осадок час тиц.
Если объем износа ниже, то можно использовать несколько образцов объемом 15 мл. объединенных вместе после
этапа расщепления папаином (перечисление о)].
b
) Аккуратно удаляют сыворотку, оставив около 1.5 мл. Ресуспецдируют осадок в 1.5 мл сыворот
ки и переносят раствор в 2-миллиметровую пробирку для микроцентрифугирования.
c) Центрифугируют раствор при 16000 д в течение 10 мин. Аккуратно удаляют жидкость с по
мощью микропипетки, не затрагивая осадок на дне пробирки.
d) Ресуслендируют осадок в SDS (2.5 г/100 мл дистиллированной воды).
e) Кипятят пробирки в течение 10 мин.
f) Охлаждают при комнатной температуре в течение 10 мин.
д) Центрифугируют пробирки при 16000 д в течение 10 мин.
h) Аккуратноудаляютжидкостьс помощью микропипетки, не затрагиваяосадокна дне пробирок.
i) Промывают осадок в 1мл ацетона, разбавленногодистиллированной водой, с объемной долей
ацетона 80 %. Центрифугируют пробирки при 16000 д в течение 10 мин. Аккуратно удаляют жидкость с
помощью микропипетки, не затрагивая осадок на дне пробирок.
j) Промывают осадокв 1мл 250 мМ натрий-фосфатном буфере, содержащем 25 мМ ЭДТА. pH 7.4.
Центрифугируют пробирки при 16000 д в течение 10 мин. Аккуратно удаляют жидкость с помощью мик
ропипетки. не затрагивая осадок на дне пробирок.
k) Повторяют действия по перечислению j) еще два раза.
l
) Ресуслендируют осадок в 1 мл 250 мМ натрий-фосфатном буфере, содержащем 25 мМ ЭДТА.
pH 7.4. иобрабатывают ультразвуком в течение 10—15с. используя ультразвуковой дезинтегратор кле
ток. оснащенный титановым микрозондом, либо в обрабатываемой ультразвуком водяной бане в тече
ние 30 мин.
9