ГОСТ РИСО 17853—2012
Можно использовать другие время и скорость ультрацентрифугирования, если при этом достига
ется такая же степень разделения и результаты, верифицирующие соответствие разделения, былидо
кументированы.
П р и м е ч а н и е 1 — Первый шаг ультрацентрифугирования служит для отделения более легких полиэ
тиленовых частиц износа от более тяжелых фракций. Второй шаг ультрацентрифугирования необходим для очис тки
выделенных полиэтиленовых частиц в меньшем градиенте плотности.
П р и м е ч а н и е 2 — Этот метод может не работать а присутствии наиболее крупных частиц полиэтиле
на. и. следовательно, общий объем износа не может быть выделен.
4.3 Методика выделения металлических частиц
Из-за растворения металлов в сильных кислотах и щелочах необходимо использовать методы
ферментативного гидролиза.
Приведенный ниже метод был описан в [5] и сходен с процедурой, разработанной ранее той же
группой авторов, для выделения частиц из лубриканта симулятора сустава [6] (см. раздел 5), с незначи
тельными различиями на начальных этапах, атакже различиями в концентрации фермента с учетом ис
пользования образцов ткани вместо сывороточного лубриканта.
П р и м е ч а н и е 1 — Возможность использования одинаковой процедуры для изоляции и характеристики
частиц из тканей и лубриканта симулятора сустава позволяет проводить прямое и точное сравнение изолирован
ных частиц (7J. что важно, например, для валидации симулятора сустава. Это значительное преимущество данной
процедуры.
a) Разрезают ткань на мелкие кусочки с помощью скальпеля и лезвия для ускорения фермента
тивного гидролиза. Ресуспендируют несколько маленьких кусочков ткани (около 2 x2 x2 мм) в пробир
ках объемом 2 мл.
П р и м е ч а н и е 2 — Масса образца ткани зависит от общего износа имплантата, наблюдаемого у паци
ента. а также участка ткани, используемого для выделения частиц (например, гранулема, капсула).
Рекомендованная сырая масса составляет от 100до 150 мг, но при необходимости может бытьот
корректирована.
b
) Промывают четыре раза в течение 2 мин в натрий-фосфатном буфере (см. 3.2.8). pH 7.4.
c) Ресуспендируют кусочки ткани в 1 мл SDS (см. 3.2.11) (2.5 г/100 мл дистиллированной воды) и
кипятят в течение 10 мин. Во время кипения гомогенизируют кусочки ткани в растворе с помощью стек
лянного гомогенизатора Поттера с тефлоновым пестиком (см. 3.3.18) каждые 2 мин.
d) Охлаждают при комнатной температуре в течение 10 мин.
l
e) Центрифугируют пробирки при 16000 д в течение 10 мин.
f) Промывают один раз 1 мл ацетона (см. 3.2.2). разбавленного дистиллированной водой, с объ
емной долей ацетона 80 %. Центрифугируют при 16000 д в течение 10 мин.
д) Промывают три раза 1 мл 250 мМ натрий-фосфатного буфера, содержащего 25 мМ ЭДТА.
pH 7.4. Для каждой промывки центрифугируют при 16000 д в течение 10 мин.
h) Обрабатывают ультразвуком в 1 мл 250 мМ натрий-фосфатном буфере, содержащем 25 мМ
ЭДТА. pH 7.4. в течение 20—25 с. используя ультразвуковой дезинтегратор клеток, оснащенный микро
зондом. либо в обрабатываемой ультразвуком водяной бане в течение 30 мин.
Использование ультразвукового дезинтегратора клеток является более эффективным, однако
для предотвращения возможной контаминации титаном из наконечника зонда следует использовать
дезинтегратор с чистым и неловрежденным/некорродированным наконечником.
i) Добавляют 0.5 мл 250 мМ натрий-фосфатногобуфера, содержащего 25 мМ ЭДТА. pH 7.4. и рас
твор папаина (см. 3.2.7) (4,8 единиц фермента на 1,5 мл натрий-фосфатного буфера). Инкубируют на
водяной бане с перемешиванием (см. 3.3.22) в течение 24 ч при температуре 65 °С.
j) Центрифугируют пробирки при 16000 д в течение 10 мин.
k) Аккуратноудаляютжидкостьс помощьюмикропипетки, не затрагивая осадокнадне пробирок.
) Ресуспендируют осадок в 1 мл SDS (2.5 г/100 мл дистиллированной воды).
т ) К
ипятят в
течение 10 мин.
п) Охлаждают при комнатной температуре в течение 10 мин.
о) Центрифугируют пробирки при 16000 д в течение 10 мин.
р) Аккуратно удаляют жидкостьс помощью микропипетки, незатрагивая осадок на дне пробирок.
4