ГОСТ РИСО 17853—2012
Использование ультразвукового дезинтегратора клеток является более эффективным, однако
для предотвращения возможной контаминации титаном из наконечника зонда следует использовать
дезинтегратор с чистым и неповрежденным/некорродированным наконечником.
т ) Добавляют 0,5 мл 250 мМ натрий-фосфатного буфера, содержащего 25 мМ ЭДТА. pH 7.4. и па-
паин (4.8 единиц фермента на 1.5 мл натрий-фосфатного буфера). Инкубируют на водяной бане с пере
мешиванием в течение 24 ч при температуре 65 °С.
п) Центрифугируют пробирки при 16000 д в течение 10 мин.
о) Аккуратно удаляют жидкостьс помощью микропипетки, незатрагивая осадок на дне пробирок.
Если изначально использовались несколькообразцов по 15 мл каждый (в случае незначительного
износа), соответствующие осадки необходимо ресуспендировать в дистиллированной воде и объеди
нить в одну пробирку вобщем объемедистиллированной воды 1мл. Полученную в результате пробирку
центрифугируют при 16000 д в течение 10 мин. а затем удаляют жидкость с помощью микропипетки, не
затрагивая осадок на дне пробирок.
р) Ресуспендируют осадок в 1 мл SDS (2,5 г/100 мл дистиллированной воды).
q) Кипятят в течение 10 мин.
г) Охлаждают при комнатной температуре в течение 10 мин.
s) Центрифугируют пробирки при 16000 д в течение 10 мин.
t) Аккуратно удаляют жидкостьс помощью микропилеткм, не затрагивая осадок надне пробирок.
и) Промывают осадок в 1мл 50 мМ Трис-буфере. pH 7.6. Центрифугируют пробирки при 16000 д в
течение 10 мин. Аккуратно удаляют жидкость с помощью микропипетки, не затрагивая осадок на дне
пробирок.
v) Повторяют действия по перечислению и).
w) Ресуспендируют осадок в 1 мл 50 мМ Трис-буфере и обрабатывают ультразвуком в течение
5 с. используя ультразвуковой дезинтегратор клеток, оснащенный титановым микрозондом, либо в об
рабатываемой ультразвуком водяной бане в течение 30 мин.
Следует обратить внимание, что использование ультразвуковогодезинтегратора клеток является
более эффективным, однако для предотвращения возможной контаминации титаном из наконечника
зонда следует использовать дезинтегратор с чистым и неповрежденным/некорродированным наконеч
ником.
x) Добавляют протеиназу К (0.9 г/мл в Трис-буфере для исходного объема сыворотки 15 мл. кон
центрация должна быть подобрана в зависимости от начального объема сыворотки) и инкубируют в те
чение 24 ч при температуре 55 ’С на водяной бане с перемешиванием.
у) Центрифугируют пробирки при 16000 д в течение 15 мин.
z) Аккуратноудаляютжидкость с помощьюмикропипетки, незатрагивая осадокнадне пробирок.
аа) Добавляют 1 мл SDS (2.5 г/100 мл дистиллированной воды).
ЬЬ) Кипятят в течение 10 мин.
сс) Охлаждают при комнатной температуре в течение 10 мин.
dd) Центрифугируют пробирки при 16000 д в течение 15 мин.
ее) Аккуратно удаляютжидкость с помощью микропипетки, незатрагиваяосадок надне пробирок.
ff) Промывают осадок в 1мл 50 мМ Трис-буфере (pH 7.6). Центрифугируютпробирки при 16000 д в
течение 15 мин. Аккуратно удаляют жидкость с помощью микропипетки, не затрагивая осадок на дне
пробирок.
gg) Промывают осадок в 0.5 мл 80 %-ного ацетона, содержащего 3 % SDS (3 г/100 мл раствора в
80 %-ном ацетоне). Центрифугируют пробирки при 16000 д в течение 15 мин и аккуратно удаляют жид
кость с помощью микропипетки, не затрагивая осадок на дне пробирок.
hh) Промывают осадок в 1 мл дистиллированной воды. Центрифугируют пробирки при 16000 д в
течение 15 мин и аккуратно удаляют жидкость с помощью микропипетки, не затрагивая осадок на дне
пробирок.
ii) Добавляют абсолютный этанол и хранят при температуре 4 °С в процессе накопления частиц
(см. 5.3.3).
Данный метод эффективен для выделения частиц из 95 %-ной сыворотки. В случав более низкого
содержания сыворотки некоторыеэтапы возможноопустить. Однакопри сравнении частицизлубрикан-
та для симулятора сустава и частиц из тканейдля точности сравнения необходимо применятьодинако
вые методы.
ю