ГОСТР ИСО 21148—2011
А.2 Окраска по Г раму (модифицированный метод Хакера)
А.2.1 Общие требования
Данное окрашивание бактериальных клетокдопускает описание морфологии бактерий и их классификацию
на две группы взависимости от того,способны они удерживатьфиолетовую окраскукристаллического фиолетового
красителяв условиях испытаний или нет. Подобноеделениеобусловлено, главным образом, различиями а структу
ре клеточных стенокдвух групп и коррелируется сдругими существенными различиями между этимидвумя группа
ми. Существует ряд способов рассмотрения окраски ло Граму. однако все они следуют последовательностям,
приводимым ниже.
А.2.2 Растворы
А.2.2.1 Общие требования
Могут использоваться технически чистые растворы. В этом случае следуют рекомендациям изготовителя
А.2.2.2 Раствор кристаллический фиолетовый
А.2.2.2.1 Химический состав
Кристаллический фиолетовый — 2.0 г.
Этиловый спирт (95 %)— 20 см3;
Оксалат аммония (C2H
b
N204) — 0.8 г.
Вода— 80 см3.
А.2.2.2.2 Приготовление
Растворяют фиолетовый кристаллический в этиловом спирте и оксалат аммония — в дистиллированной
воде. Смешиваютдва раствора идаютотстояться смеси в течение 24 ч перед применением.
А.2.2.3 Раствор йода
А.2.2.3.1 Химический состав
Йод—
1.0
г.
— 2.0 г;
— 100 см3.
Йодид калия (KI)
Вода
А.2.2.3.2 Приготовление
Йодидкалия растворяют в 10см3дистиллированной воды,добавляютчастями йод. После растворениядово
дят объем раствора в мерной колбе до 100 см3.
А.2.2.4 Раствор сафранина
А.2.2.4.1 Химический состав
— 0,25 г;
— 10 см3;
— 100 см3.
Сафранин О
Этиловый спирт (95%)
Вода
А.2.2.4.2 Приготовление
Растворяют сафранин в этиловом спирте, затем смешивают с дистиллированной водой. Доводят объем
раствора до 100 см3.
При использовании раствора фиолетового кристаллического проверяют стабильность раствора. Для про
верки смешивают одну каплю раствора кристаллического фиолетового с одной каплей раствора йода на предмет
ном стекле, чтобы проследить за химической реакцией. Если на стекле видна кристаллизация, раствор
фиолетового кристаллического не используют.
А.2.2.5 Метод окрашивания
После фиксации на предметном стекле (например, пламенем) бактериального мазка, приготовленного из
18—24-часовой культуры или из помутневшего бульона, покрывают мазок раствором кристаллического фиолето
вого (А.2.2.2). Дают реагировать в течение 1мин.
Осторожно промывают наклоненное предметное стекло водой в течение нескольких секунд.
Покрывают предметное стекло раствором йода (А.2.2.3). Дают ему реагировать в течение 1мин. Затем осто
рожно промывают наклоненное предметное стекло водой в течение нескольких секунд.
Наносятосторожно и непрерывно пленку этилового спирта (95 %) на наклонное предметное стекло не более
чем 30 с и до тех пор. пока не перестанет выступать фиолетовый цвет.
Наклоненное предметное стекло осторожно промывают водой втечение нескольких секунд.
Предметное стекло покрывают раствором сафранина (А.2.2.4)в течение Юс.
Осторожно промывают наклоненное предметное стекло водой.
Предметное стекло высушивают.
А.2.2.6 Интерпретация
Исследуют предметное стекло под объективом микроскопа с большим увеличением (4.13). Те бактериаль
ные клетки, которые окрасились в синий или фиолетовый цвет, относяткчислу грамположительных. окрашенные в
темно-розовый и красный — к грамотрицательным.
В отношении чистой культуры некоторых бактериальных типов как грамположительные, так и грамотрица-
тельные клетки могут быть получены в одном и том же поле зрения микроскопа.
П р и м е ч а н и е — У плотноупакованных клеток может отмечаться нехарактерная реакция.
12