ГОСТ Р ИСО 20776-1— 2010
Окончательный состав инокулюма должен содержать 5x10s КОЕ/мл (диапазон от 2x10sдо
8х105КОЕ/мл).
3.4.2 Метод бульонной культуры
Три — пять колоний берут петлей с неселективной питательной агаровой среды и перемещают в
бульон типа триптиказо-соевого или бульона из сердечно-мозговой вытяжки. Используемый бульон не
должен бытьантагонистом по отношению к проверяемому антибактериальномуагенту. Бульон инкубируют
при 34 °С — 37 °С. пока рост не достигнет мутности, равной или превышающей 0,5 стандарта McFarland.
Если нужно, культура может быть отрегулирована с помощью солевого раствора или бульона до мутности,
эквивалентной 0,5 стандарта McFarland. Это может быть сделано с помощью фотометрического
устройства (используют длину волны 625 нм и кювету с длиной светового пути 1см. абсорбция составит
0.08— 0.13) или соответственно откалиброванного нефелометра. Такой же результат может бытьдостигнут
путем визуального сравнения появляющихся в инокулюме черных линий и суспензии 0,5 стандарта
McFarland (инокулюм и стандарт McFarland должны находиться в пробирках одного и того же размера) или
любым другим методом, который дает воспроизводимую концентрацию КОЕ/мл.
П р и м е ч а н и е — 0.5 стандарта McFarland можно получить, добавляя аликвоту 0.5 мл 0.048 моль/л ВаС12
(11.72 r/л ВаС12- 2Н20)
к
99.5 мл из 0.18 моль/лпри постоянном встряхивании для сохранения суспензии.
3.4.3 Метод суспензии колоний
Три — пять колоний из неселективной питательной агаровой среды (инкубированной при
34 °С — 37 гС в течение 18 — 24 ч. если более длинная инкубация не требуется) берут петлей и перемеща
ют в стерильный бульон или соляной раствор. Суспензию регулируют для получения мутности, эквивален
тной 0.5 стандарта McFarland, как описано в 3.4.2для метода бульонной культуры.
Для всех организмов точная концентрация жизнеспособных клетокв окончательном инокулюме зави
ситот состояния культуры. Этот эффект наиболее выражен у прихотливых организмов, типа Streptococcus
pneumoniae, использование старых культур которых может значительно сократить число жизнеспособных
клеток в суспензии.
Точно отрегулированная суспензия, подготовленная любым методом, содержит приблизительно
1 х 10еКОЕ/мл для обычных бактерий.
Отрегулированный инокулюм, приготовленный, как указано выше, разводят в бульоне, чтобы
получить окончательную концентрацию числа клеток 5х105 КОЕ/мл (в диапазоне от 2x105КОЕ/мл до
8x10s КОЕ/мл). Требуемое разведение зависит от проверяемого организма и метода, используемого для
подготовки инокулюма. Перемещение 0.1 мл суспензии стандартизированного организма в пробирку, со
держащую 9.9 мл (разведение 1:100) бульона, дает суспензию с концентрацией клеток 1х 106 КОЕ/мл. при
добавлении 50 мкл которой к равному объему (50 мкл) раствора антибактериального агента получают
окончательный состав инокулюма 5x10sКОЕ/мл для многих грамотрицательных бактерий (например,
Escherichia coli). Если лунки уже содержат по 100 мкл антибактериального агента в бульоне, соответствую
щее разведение, чтобы получить необходимый окончательный инокулюм. должно быть приготовлено пу
тем добавления по 5 мкл разведенной суспензии в каждую лунку. Для грамположительных организмов
может бытьдостаточным меньшее разведение суспензии 0,5 McFarland, как определено подсчетом коло
ний в предварительных испытаниях.
3.5 Инокулированио планшетов для микроразведения
Планшеты должны инокулироваться в пределах 30 мин стандартизации суспензии инокулюма. что
бы сохранить концентрацию числа жизнеспособных клеток. Ккаждой лунке, содержащей 50 мкл антибакте
риального агента, разведенного в бульоне (см. 3.3). добавляют 50 мкл бактериальной суспензии (см. 3.4).
В лунки планшета, которые содержат по 100 мкл антибактериального агента, разведенного в бульоне,
должно быть добавлено по 5 мкл разведенной суспензии инокулюма.
Подсчетжизнеспособных клеток должен быть выполнен на испытуемой суспензии, чтобы гарантиро
вать, что тестовые лунки содержат приблизительно 5х105 КОЕ/мл. Для этого берут 10 мкл из лунки
контроля роста немедленно после инокулирования и разводят эту аликвоту в 10 мл бульона или солевого
раствора. 100 мкл этого разведения распределяют по поверхности подходящей агаровой пластины,
которую затем инкубируют в течение ночи. Ожидается появление от 20 до 80 колоний от приемлемой
испытуемой суспензии. Если этого не удается получить, результаты для этого штамма не могут быть
использованы.
3.6 Инкубация планшетов для микроразведения
Планшеты для микроразведения должны быть запечатаны в пакеты из полиэтилена или прижаты
плотной крышкой или клейкой пленкой перод инкубацией, чтобы предотвратить высушивание. Чтобы избе-
9