С. 7 ГОСТ 13496.21-87
старта). Налипни старта размечают 12 полосок длиной I см с расстоянием между ними 0,5 см. Каж
дую полоску ограничивают вертикальными бороздками (бороздки проводят острым предметом) для
предотвращения расплывания пятен в ширину при хроматографировании.
3.4.2.3. Подготовка камеры для хроматографии
Для определения лизина камеру предварительно насыщают буферным раствором с pH 3,3. для
триптофана —с pH 6,0. Стенки камеры выстилают одним слоем фильтровальной бумаги и на дно
наливают растворитель слоем 1.5 см. Герметично закрытую камеру помещают в термостат с темпе
ратурой хроматографирования соответствующей аминокислоты на 15—20 мин до полного
пропитывания бумаги.
3.4.2.4. Подготовка микрошприца
Из микрошприца удаляют шток, а на верхний конец стеклянного цилиндра надевают резино
вую трубку длиной 30 мм. Конец иглы микрошприца обрезают перпендикулярно ее длине на уровне
половины скоса и срез зашлифовывают во избежание повреждения слоя смолы при нанесении рас
творов.
3.4.2.5. Нанесение растворов на пластинки
Гидролизаты и стандартные рабочие растворы аминокислот наносят на полоски хроматогра
фической пластинки в токе теплого воздуха электрофена. Нанесенный на полоску раствор высуши
вают феном. Операцию нанесения и высушивания раствора повторяют до тех пор. пока не будет на
несена вся микродоза. Язя проб с содержанием лизина до 10 г на 1 кг и триптофана до 2 г на I кг
наносят 0.01 см3 гидролизата, для проб с большим содержанием аминокислот —0.005 см3. В таких же
обьемах наносят и стандартные рабочие растворы аминокислот. На одну пластинку наносят гид
ролизат 4 проб в двух повторностях и три стандартных рабочих раствора аминокислот с концентра
циями. близкими по содержанию их в испытываемых пробах.
3.4.3. Х р о м а т о г р а ф и р о в а н и е
3.4.3.1. Усювия хроматографирования для лизина
Пластинку с нанесенным гидролизатом накладывают обратной стороной на стекло такого же
размера. К верхнему краю пластинки прикрепляют фильтровальную бумагу размером 20 х 15 см так.
чтобы верхний коней покрывал ионообменный слой шириной 1см, а свободный загибают на про
тивоположную сторону стекла. На 1-сантиметровыЙ край бумаги накладывают полоску плексигласа
и закрепляют резиновым кольцом. Затем пластинку помещают в предварительно нагретую до тем
пературы 60 ‘С камеру так, чтобы нижний край был погружен в буферный раствор с pH 3,3 на 1см.
Камеру герметично закрывают и помешают в термостат. Хроматографирование проводят при тем
пературе 60 ‘С в течение 5 ч.
3.4.3.2. Условия хроматографирования для триптофана
Пластинку с нанесенным гидролизатом накладывают обратной стороной на стекло такого же
размера и помешают в предварительно нагретую до температуры 30 “С камеру так, чтобы нижний
край был погружен в буферный раствор с pH 6,0 на 1см. Камеру герметично закрывают и помешают в
термостат. Хроматографирование проводят при температуре 30 *С в течение 3 ч.
3.4.4. Пр о я в л е н и е х р о ма т о г р а ммы
По окончании хроматографирования пластинки вынимают из камеры и высушивают при ком
натной температуре в вытяжном шкафу. Кадмиево-нингидрнновый реактив (смесь растворов Л и В)
распыляют пульверизатором по всей поверхности пластинки до полного смачивания. Реактив нано
сят равномерно, не допуская подтеков. После опрыскивания пластинку высушивают на воздухе
в вытяжном шкафу и помещают на ночь в термостат при температуре 30 *С для полного развития
окраски зон аминокислот.
3.4.5. Д е н с и т о м е т р и р о в а н и е
Пластинку разрезают на отдельные хроматограммы и денситометрируют при длине волны
530 нм. В результате получают денситограмму с пиками кривых, площади которых пропорциональ
ны концентрациям аминокислот.
Площадь пика определяют по п. 2.4.2.
Массовую концентрацию аминокислоты в гидролизате пробы определяют по градуировочно
му графику.
Градуировочный график строят для каждой хроматографической пластинки. На оси абсцисс
откладывают концентрации трех стандартных рабочих растворов, а по оси ординат соответствую
щие им площади пиков.
174