12
Бактерии вида Pseudomonas aeruginosa на селективно-диагностических средах образуют колонии разного размера, часто с неровными краями.
Из каждой чашки, на которой обнаружены типичные колонии, выбирают по пять хорошо изолированных колоний каждого типа, отличающиеся по морфологии, и пересевают на поверхность питательного агара.
Посевы инкубируют при температуре (37 + 1) °С в течение (24 + 2) ч.
- Подтверждение принадлежности типичных колоний к бактериям вида Pseudomonas aeruginosa
Принадлежность выросших культур к бактериям вида Pseudomonas aeruginosa подтверждают по отношению к окраске по Граму, присутствию оксидазы и при необходимости определяют ферментацию мальтозы и редукцию нитратов.
- Окраска по Граму
Приготовление мазков из культур, выросших на скошенной поверхности питательного агара по 9.1.4, и их окраску по Граму проводят по ГОСТ 30425.
Бактерии вида Pseudomonas aeruginosa — грамотрицательные палочки.
Допускается окраску по Граму заменять тестом Грегерсена. Для этого на предметном стекле в капле 3 %-ного водного раствора калия гидроокиси эмульгируют культуру микроорганизмов, взятую из колонии с плотной среды.
Если через несколько секунд взвесь ослизняется и за петлей тянутся слизистые нити, то это указывает на принадлежность испытуемой культуры к грамотрицательным бактериям. У грамположитель- ных бактерий слизистых нитей не образуется.
- Определение присутствия оксидазы
Применяя платиново-иридиевую петлю или стеклянную палочку, отбирают культуры, выросшие на поверхности питательного агара по 9.1.4, и наносят штрихи на фильтровальную бумагу, смоченную реактивом для определения оксидазы.
Если при этом фильтровальная бумага не потемнеет в течение 10 с, то это означает, что бактерии вида Pseudomonas aeruginosa в анализируемой пробе не присутствуют и результат испытания считают отрицательным.
Для определения оксидазы допускается использовать диски и растворы отечественного и импортного (зарегистрированные в установленном порядке) промышленного производства. Для контроля качества дисков и растворов применяют музейные оксидазоположительные и оксидазоотрицательные культуры.
- Определение ферментации мальтозы
Для определения ферментации мальтозы испытуемую культуру высевают уколом в среду Гисса с мальтозой.
Посевы термостатируют при температуре (37 + 1) °С в течение (24 + 2) ч.
Бактерии вида Pseudomonas aeruginosa мальтозу не ферментируют.
- Определение редукции нитратов
При постановке реакции на подтверждение редукции нитратов предварительно убеждаются в том, что сама среда не содержит нитритов. Для этого в две контрольные пробирки со средой добавляют по 2 капли каждого из реактивов, приготовленных по 6.12 и 6.13. Если в течение 15 мин не происходит покраснения среды, то ее используют для определения нитратредуцирующей способности. При использовании агаризованной среды реактивы наносят на поверхность скошенного нитратного агара.
Для подтверждения редукции нитратов проводят посевы в пробирки с нитратной средой. Посевы термостатируют при температуре (37 + 1) °С в течение (24 + 2) ч, затем добавляют по две капли каждого из реактивов, приготовленных по 6.12 и 6.13.
Если в течение 15 мин не происходит покраснения среды, то добавляют в посев немного порошкообразного цинка и выдерживают еще 10 мин. Если после добавления цинка среда краснеет, то редукции нитратов вследствие отсутствия бактерий вида Pseudomonas aeruginosa не произошло и тест считают отрицательным. Если после добавления цинка среда не краснеет, то делают вывод о том, что редукция нитратов вследствие присутствия бактерий вида Pseudomonas aeruginosa произошла.
Бактерии вида Pseudomonas aeruginosa вызывают редукцию нитратов.
- По результатам подтверждения к бактериям вида Pseudomonas aeruginosa относят аэробные не образующие спор грамотрицательные оксидазоположительные палочки, образующие пигменты флюоресцин и пиоционин, не ферментирующие мальтозу, вызывающие редукцию нитратов.
- Определение количества бактерий вида Pseudomonas aeruginosa по методу НВЧ
Для посева используют не менее трех последовательных анализируемых проб продукта, отличающиеся между собой по массе или объему в 10 раз. Каждой анализируемой пробой продукта засевают три повторности. Выбираемая последовательность анализируемых проб зависит от предполагаемого уровня обсемененности продукта или от нормативного значения.