ГОСТ Р 54905—2012
8
5.5 Подготовка проб
Отбор проб — по 4.5.1. Приготовление основного раствора анализируемой пробы проводят по
4.5.2.
5.5.1 Приготовление рабочего раствора анализируемой пробы
Рабочий раствор анализируемой пробы готовят из основного раствора (4.5.2) путем разведения
его дистиллированной водой таким образом, чтобы при определении активности оптические плотности
опытных и контрольного растворов находились в пределах рабочей зоны градуировочного графика.
Рабочий раствор должен содержать от 0,01 до 0,05 ед.
β
-ГлА в 1 см
3
.
Раствор готовят в день определения.
5.6 Проведение анализа
5.6.1 В три пробирки (две опытные и одну контрольную) вносят по 1 см
3
субстрата
β
-глюкана
(4.3.4). Пробирки закрывают пробками, помещают в ультратермостат или на водяную баню с темпера-
турой (50 ± 1) °С и выдерживают в течение 5 мин.
5.6.2 В две опытные пробирки добавляют по 1 см
3
рабочего раствора анализируемой пробы
(5.5.2), предварительно прогретой при температуре 50 °С, и тщательно перемешивают. Три пробирки
(две опытные и одну контрольную) помещают в ультратермостат или на водяную баню с температурой
(50 ± 1) °С на 10 мин (с точностью, определяемой по секундомеру).
5.6.3 В контрольную пробирку вносят 1 см
3
рабочего раствора анализируемой пробы (5.5.2).
5.6.4 Во все пробирки добавляют 1 см
3
реактива Шомоди (5.3.3). Пробирки выдерживают 20 мин в
кипящей водяной бане, затем охлаждают до комнатной температуры. Добавляют 1 см
3
реактива Нель-
сона (5.3.4), перемешивают на вортексе в течение 5 мин. В пробирки добавляют по 5 см
3
дистилли-
рованной воды и центрифугируют при 3000 мин
–1
в течение 5 мин или фильтруют через воронку со
стеклянным фильтром.
5.6.5 Осветленные растворы (центрифугаты или фильтраты) колориметрируют на фотоэлектро-
колориметре или спектрофотометре при длине волны 660 нм в кюветах с толщиной поглощающего свет
слоя 10 мм против контрольной пробы на реактивы (5.4.2).
Если значения оптических плотностей в опытных пробирках находятся за пределами рабочей
зоны градуировочного графика, определение активности следует повторить с раствором, имеющим
большее или меньшее содержание фермента.
6 Обработка результатов
6.1 Молярную концентрацию глюкозы (мкмоль/см
3
) в опытных и контрольном растворах опреде-
ляют по градуировочному графику.
6.2 Ферментативную активность
β
-глюканазы в анализируемой пробе
β
-ГлА, ед./г, рассчитывают
по формуле
tc
b
-
Г
лА
=
(C
o
−
C
к
)
,
(1)
о
где С — молярная концентрация глюкозы в опытной пробе, найденная по градуировочному графи-
ку, мкмоль/см
3
;
к
С — молярная концентрация глюкозы в контрольной пробе, найденная по градуировочному гра-
фику, мкмоль/см
3
;
t — продолжительность гидролиза, мин;
с — массовая концентрация ферментного препарата в 1 см
3
рабочего раствора анализируемой
пробы, г/см
3
, которую рассчитывают по формуле
m
c
=
VP
,
(2)
где m — масса пробы ферментного препарата, г;
V — объем разведения пробы при приготовлении основного раствора по 4.3.5.1, см
3
;
P — разведение основного раствора ферментного препарата для приготовления рабочего раство-
ра по 4.5.4 или 5.5.2.