ГОСТ Р 54905—2012
4.6.3 В контрольную пробирку вносят 1 см
3
рабочего раствора анализируемой пробы (4.5.3).
4.6.4 В три пробирки (две опытные и одну контрольную) добавляют по 3 см
3
реактива ДНС (4.3.3)
и тщательно перемешивают. Пробирки помещают на кипящую водяную баню на 5 мин (с точностью,
определяемой по секундомеру).
4.6.5 Пробирки охлаждают до комнатной температуры и колориметрируют содержимое на фото-
электроколориметре или спектрофотометре при длине волны 540 нм в кюветах с толщиной поглощаю-
щего свет слоя 10 мм против контрольной пробы на реактивы (4.4).
Если значения оптических плотностей в опытных пробирках находятся за пределами рабочей
зоны градуировочного графика, определение активности следует повторить с раствором, имеющим
большее или меньшее содержание фермента.
5 Метод определения ферментативной активности
β
-глюканазы
по Шомоди-Нельсону
5.1 Сущность метода
5.1.1 Метод основан на количественном определении редуцирующих (восстанавливающих) саха-
ров, образующихся при действии
β
-глюканазы на
β
-1,4 связи
β
-глюкана при определении в стандартных
условиях.
5.1.2 Сущность метода Шомоди-Нельсона заключается во взаимодействии карбонильных групп
редуцирующих сахаров с двухвалентными ионами меди и арсено-молибденовым реактивом с образо-
ванием голубого цвета, интенсивность которого определяют колориметрически при длине волны 660 нм.
5.1.3 За единицу
β
-глюканазной активности (1 ед.
β
-ГлА) принимают количество фермента, дей-
ствующее на
β
-глюкан с высвобождением 1 мкмоля восстанавливающих сахаров (в пересчете на глю-
козу), образующихся за одну мин при стандартных условиях: температуре 50 °С; 4,7 ед. рН; продолжи-
тельности гидролиза 10 мин.
5.1.4 Содержание редуцирующих сахаров, образующихся в результате ферментативной реакции,
определяют колориметрическим методом по Шомоди-Нельсону и рассчитывают по градуировочному
графику, построенному для глюкозы.
5.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда, реактивы и материалы
5.2.1 Для определения ферментативной активности
β
-глюканазы применяют средства измере-
ний, вспомогательное оборудование, посуду и материалы, которые указаны в 4.2.1 и 4.2.2, при этом
фотоэлектроколориметр или спектрофотометр должен обеспечивать измерения при длине световой
волны 660 нм. А также применяют:
- встряхиватель V-3 типа вортекс или аналогичный.
5.2.2 При определении ферментативной активности
β
-глюканазы применяют реактивы по 4.2.3,
за исключением натрия гидроокиси, этилового спирта и ДНС, вместо которых применяют:
- натрий углекислый безводный с содержанием основного вещества не менее 99,8 %, х. ч.;
- натрий двууглекислый (бикарбонат) по ГОСТ 2156;
- натрий сернокислый по ГОСТ 4166;
- медь (II) сернокислую 5-водную по ГОСТ 4165;
- кислоту серную концентрированную по ГОСТ 4204;
- аммоний молибденовокислый по ГОСТ 3765;
- натрий арсенат 7-водный массовой долей основного вещества 98 %.
5.3 Подготовка к анализу
6
5.3.1 Приготовление ацетатного буферного раствора молярной концентрации 0,1 моль/дм
3
4,7 ед.
рН из растворов уксусной кислоты и уксуснокислого натрия проводят по 4.3.1.
5.3.2 Приготовление субстрата — раствора
β
-глюкана массовой долей 0,5 % — по 4.3.4.
5.3.3 Приготовление реактива Шомоди
5.3.3.1 Приготовление реактива А
В мерную колбу вместимостью 500 см
3
вносят (12,5 ± 0,01) г натрия углекислого безводного,
(12,5 ± 0,01) г калий-натрия виннокислого 4-водного, (10 ± 0,01) г натрия двууглекислого и (100 ± 0,01) г
натрия сернокислого, растворяют приблизительно в 300 см
3
дистиллированной воды. Натрий сернокис-