ГОСТ Р 54637—2011
2
3
2
3
Анализируемые пробы гомогенизируют, избегая воздействия повышенной температуры.
8.2.3 Для омыления испытуемой пробы, содержащей менее 30 % жира, 5—20 г исследуемого
материала помещают в плоскодонную колбу вместимостью 100—500 см
3
, добавляют 90—100 см
3
эти-
лового ректификованного спирта, 1 г аскорбиновой кислоты (или 1 г пирогаллола), 50 см
3
50 %-ного
раствора гидроокиси калия. Перед омылением в колбу вносят соответствующее количество раствора
внутреннего стандарта. Количество витамина D должно быть близким к ожидаемому количеству вита-
мина D в анализируемом образце. Омыление проводят в течение 30 мин на водяной бане с обратным
холодильником (желательно в токе азота) при температуре 70 °C—80 °C.
При проведении щелочного гидролиза при комнатной температуре в течение не менее 16 ч ис-
пользуют вышеуказанные соотношения материала и реактивов.
8.2.4 Для омыления испытуемой пробы, содержащей более 30 % жира, в колбу для омыления
вносят 5—20 г исследуемого материала, добавляют 90—100 см
3
спирта этилового, примерно 1 г аскор-
биновой кислоты (или 1 г пирогаллола), 50 см
3
50 %-ного раствора гидроокиси калия. Перед омылени-ем
в колбу вносят соответствующее количество раствора внутреннего стандарта витамина D , количе-ство
которого должно быть близким к ожидаемому количеству витамина D в анализируемом образце.
Омыление проводят на водяной бане в течение 30—45 мин (желательно в токе азота) при температуре
95 °C—100 °C.
Рекомендуемое добавляемое количество внутреннего стандарта приведено в таблице 1.
Таблица 1 — Количество добавляемого внутреннего стандарта витамина D
2
3
Заявленное содержание витамина D ,
млн
-1
Навеска пробы, г
Количество вносимого раствора
внутреннего стандарта, см
3
От 0,1 до 0,3 включ.
20
3
Св. 0,3 до 0,6 включ.
10
3
Св. 0,6 до 1,0 включ.
5
2
23
Если после омыления и охлаждения жир или масло остаются на поверхности омыляемой смеси,
то вновь приливают 50 см
3
50 %-ного раствора KOH и омыление повторяют.
После окончания гидролиза, проведенного по 8.2.3 (8.2.4), содержимое колбы быстро охлаждают
до (20 ± 5) °С и количественно переносят в делительную воронку. Витамин D экстрагируют 100 см
3
н-гексана (этилацетата, петролейного или диэтилового эфира).
Для удаления воды экстракт фильтруют через фильтр с 2—5 г безводного сульфата натрия. Фильтр
промывают 20 см
3
н-гексана, затем добавляют в фильтрат 1 см
3
раствора (2 мг/см
3
) БГТ в н-гексане.
Экстракт промывают 3—5 раз порциями воды по 50—100 см
3
до исчезновения щелочной реакции про-
мывных вод (по универсальной индикаторной бумаге) и затем упаривают с помощью роторного испари-
теля при пониженном давлении и при температуре не выше 40 °С.
8.2.5 Для приготовление раствора исследуемого образца для анализа с помощью полупрепара-
тивной НФ ВЭЖХ к сухому остатку после упаривания экстракта приливают 2 см
3
н-гексана (или другого
растворителя, или смеси растворителей, которые используются в качестве подвижной фазы в системе
полупрепаративной ВЭЖХ).
8.2.6 Для выделения фракции, содержащей витамин D, 0,2—0,5 см
3
раствора по 8.2.5 элюируют
в условиях полупрепаративной ВЭЖХ и собирают элюат, содержащий смесь витаминов D и D (в ус-
ловиях НФ ВЭЖХ эти соединения элюируются одновременно), предварительно определив время удер-
живания этих соединений по 8.3. Время удерживания витамина D зависит от используемых подвижных
и неподвижных фаз и обычно составляет 10—15 мин. Общее время хроматографического разделения
составляет 25—30 мин.
8.2.7 Фракцию элюата, полученную по 8.2.6, упаривают на роторном испарителе при пониженном
давлении и температуре не более 40 °С и сухой остаток перерастворяют в 0,5 см
3
подвижной фазы для
аналитической ОФ ВЭЖХ.
8.3 Подготовка жидкостных хроматографов
Подготовку жидкостных хроматографов к работе осуществляют в соответствии с инструкцией по
эксплуатации оборудования. Перед началом работы колонки промывают элюентом.
Раствор смеси витаминов D
2
и D
3
по 8.1.2.4 несколько раз вводят в хроматограф для полупре-
7