ГОСТ 29311-92 С. 6
4.4.3. Проведение испытания
В две центрифужные пробирки вносят 0.5 см’ гидролизата, 4,5 см3 воды, добавляют 0.5 см3
10 %-ного раствора гидроксида натрия и 0,5 см32 %-ного раствора сернокислой меди. Смесь хорошо
перемешивают после добавления каждого реактива.
Параллельно ставят контрольную пробу, для чего к 0,5 см3 гидролизата добавляют 5,5 см3
дистиллированной воды. Пробы центрифугируютс частотой вращения 3000- 4000 ми»г1по 10 мин.
Интенсивность окраски измеряют на фотоэлектроколориметре или спектрофотометре при
540 нм в кюветах с толщиной поглощающегося стоя 1см. В качестве оптического контроля исполь
зуют центрифугат контрольной пробы.
4.4.4. Обработка результатов
Концентрацию полипептидов в гидролизате (Л-,) в процентах определяют по калибровочному
графику. Полученное значение умножают на коэффициент разведения, равный десяти.
За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух
параллельных определений, допускаемое расхождение между которыми не должно превышать 5 %.
4.5.Определение аминокислот
Сущность метода заключается в хроматографии аминокислот и индикации их при окраске
нингилрином а-аминогрупп, с использованием автоматического анализатора.
Дополнительно определяется содержание триптофана титрометрическим методом в реакции с
хлорамином.
4.5.1. Аппаратура и реактивы
Анализатор аминокислот.
Центрифуга настольная.
Пипетки, бюретки по ГОСТ 29227, ГОСТ 29251.
Кислота сульфосалнниловая по ГОСТ 4478, концентрации 3 %.
Реактивы для хроматографии аминокислот ос. ч. или х. ч. в соответствии с инструкцией к
прибору.
Кислота уксусная ледяная по ГОСТ 61.
Хлорамин Б. 1%-ный водный раствор.
4.5.2. Подготовка к испытанию
4.5.2.1. Депротеинизация образца гидролизата
В центрифужную пробирку вносят 3 см5 гидролизата и 3 см3 сульфосалицнловой кислоты.
Смесь центрифугируют при 4—6 тыс. мин-1 15—20 мин. Разводят 1см3супернатанта в 40—120 раз
(из расчета содержания аминного азота в конечном разведении 4—5 миллиграмм-процента) бидис-
тиллированной водой или буферным раствором pH 2.2, приготовленным в соответствии с инструк
цией к прибору. Полученный раствор фильтруют.
4.5.3. Проведение испытания
0.5 см3фильтрата наносят на колонку аминокислотного анализатора. Хроматографию амино
кислот проводят в соответствии с инструкцией к прибору.
При хроматографии с использованием двухколоночного метода и трех буферных растворов
(pH 3,25;4,25 и 5,28) обычно количественноопределяют все аминокислоты, входящие в составбелка,
за исключением триптофана. В этом случае для определения общего аминокислотного состава
гидролизата содержание триптофана определяют отдельно.
4.5.4. Определение триптофана
Втри пробирки берут по I см3предварительно профильтрованного гидролизата, добавляют по
I см3ледяной уксусной кислоты и титруют свежеприготовленным раствором хлорамина, добавляя
по 1 капле и тщательно встряхивая. По мере титрования появляется розовая окраска.
Окончанием титрования является переход окраски из максимально розовой в палевую или
желтую, который обычно происходит от одной капли хлорамина.
4.5.5. Обработка результатов
Массу аминокислот в гидролизате (XJ в процентах по хроматограмме вычисляют по формуле
v
_ /л, - /и,
К
100
Х’ЙГ’
где т, —массовая концентрация аминокислоты, мк моль/см3, рассчитанная в соответствии с ин
струкцией к прибору;
тг —молекулярная масса аминокислоты;
К —коэффициент разведения образца;