ГОСТ Р ИСО 10993.5-99
8.2.6 Добавляют известные количества пустого реактива, отрицательного и положительного
контроля в дополнительные дублирующие сосуды.
П р и м е ч а н и е — Контроль в виде свежей культуральной среды при необходимости подвергают
исследованию.
8.2.7 Инкубируют сосуды, используя условия, предложенные в 8.2.1, в течение периода вре
мени. соответствующего специфическим условиям выбранного исследования.
8.2.8 После инкубации от 24 до 72 ч определяют цитотоксичность в соответствии с 8.5. Если в
исследовании используют суспензионную кратковременную культуру подвижных клеток, то вы
тяжку помещают в сосуд перед тем, как в него добавляют клетки. После этого сразу определяют
цитотоксичность при температуре и pH, совместимых с температурой и pH клеток млекопитающих.
8.3 Исследование методом прямою контакта
Это исследование позволяет осуществить качественную и количественную оценку цитотоксич
ности.
8.3.1 Для прямого воздействия на исследуемый образен капают известное количество постоян
но помешиваемой клеточной суспензии в каждый из нужного количества сосуд. Равномерно распре
деляют клетки по поверхности каждого раствора, осторожно вращая сосуд в горизонтальной
плос кости.
8.3.2 Инкубируют культуру при температуре (37+2) *С в воздухе в присутствии 5 % (по объе
му) диоксида углерода или без нее в соответствии с выбранной для культуральной среды буферной
системой до тех пор. пока культура не вырастет приблизительно до соприкосновения клеток
в койне логарифмической фазы кривой роста.
8.3.3 Осматривают культуру, используя микроскоп.
8.3.4 Удаляют культуральную среду. Затем в каждый сосуд доливают свежую культуральную
среду.
8.3.5 Осторожно помещают отдельные препараты исследуемого образца на клеточный слой в
центре каждого дублирующего сосуда и убеждаются в том, что препарат покрывает ‘/ 14поверхности
клеточного образца.
Проявляют осторожность, чтобы предотвратить нежелательное движение препаратов, поскольку
оно может приводить к физическому повреждению клеток, которое можно наблюдать в виде участ
ков клеток, не достигших конца логарифмической фазы.
П р и м е ч а н и с — При необходимости препарат помещают в сосуд перед тем. как в него добавляют
клетки.
8.3.6 Готовят дублирующие сосуды для материалов отрицательного и положительного контро
ля.
8.3.7 Инкубируют сосуд в условиях, описанных в 8.3.2. в течение периода времени (не менее
24 ч), соответствующего специфическим условиям выбранного исследования.
8.3.8 Сливают всплывающую на поверхность культуральную среду и определяют цитотоксич
ность в соответствии с 8.5.
8.4 Исследование путем непрямого контакта
8.4.1 Диффузия агара
Это исследование используют для качественной оценки цитотоксичности. Исследование не
пригодно для вымываемых продуктов, которые не могут диффундировать через слой агара.
8.4.1.1 Ятя исследования капают известное количество постоянно помешиваемой клеточной
суспензии в каждый из нужного количества дублирующих сосудов. Распределяют клетки равномер но
по поверхности каждого сосуда, осторожно вращая сосуды в горизонтальном направлении.
8.4.1.2 Инкубируют культуры при (37 ± 2) *С в воздухе с 5 % (по объему) двуокиси углерода
или без нее в соответствии с выбранной для культуральной среды буферной системой до тех пор,
пока культуры не вырастут приблизительно до соприкосновения клеток в конце логарифмической
фазы кривой роста.
8.4.1.3 Осматривают клетки, используя микроскоп.
8.4.1.4 Удаляют из сосуда культуральную среду. Затем готовят свежую культуральную среду,
смешав сыворотку с растаявшим агаром, чтобы окончательная концентрация агара состаачяла от
0,5 до 2 г/л, и раскапывают соответствующий объем в каждый сосуд. Используют исключительно
агар, который подхода для выращивания клеток млекопитающих в культуре. Смесь культуральной
5