ГОСТ Р ИСО 10993.5-99
среды с агаром должна представлять собой жидкость, температура которой должна быть совместима
с температурой клеток млекопитающих.
П р и м е ч а н и с — Возможны поставки агара с достаточным диапазоном молекулярного веса и
чистоты.
8.4.1.5 Осторожно помещают несколько препаратов исследуемой пробы на отвердевший слой
агара в каждый сосуд. Убеждаются, что препарат покрывает приблизительно ‘/ |0 поверхности кле
точного слоя.
Все адсорбирующие материалы с культуральной средой следует смачивать перед тем, как по
местить на агар, во избежание дегидратации агара.
8.4.1.6 Готовят дублирующие сосуды с препаратами отрицательного и положительного конт
роля.
8.4.1.7 Инкубируют сосуды в условиях, представленных в 8.4.1.2, в течение периода времени
24-72 ч.
8.4.1.8 Осматривают клетки, определяют цитотоксичность перед и после удаления препаратов
с агара. Использование витальной окраски, например, нейтрального красного, способствует опре
делению цитотоксичности. Витальную краску можно добавить до или после инкубации с
препара том. Если краска добавлена перед инкубацией, защищают культуры от воздействия света во
избежа ние повреждения клеток вследствие фотоактивации витальной окраски.
8.4.2 Диффузия фильтра
Это исследование используют для качественной оценки цитотоксичности.
8.4.2.1 Помещают свободный от ПАВ фильтр размером пор 0.45 мм в каждый сосуд и добавля
ют известное количество постоянно перемешиваемой клеточной суспензии в каждый из соответ
ствующего количества дублирующих сосудов для испытания. Осторожным вращением распределяют
клетки равномерно по поверхности каждого фильтра.
8.4.2.2 Инкубируют культуры при (37 ± 2) ’С в воздухе в присутствии 5 % (по объему) двуоки
си углерода или без нее в соответствии с буферной системой, выбранной для культуральной среды
до тех пор. пока культура не вырастет приблизительно до соприкосновения клеток в конце
лога рифмической фазы кривой роста.
8.4.2.3 Осматривают культуры, используя микроскоп.
8.4.2.4 Удаляют из сосудов культуральную среду. Затем фильтры стороной, на которой находят
ся клетки, помешают на слой отвердевшего агара (см. 8.4.1.5).
8.4.2.5 Осторожно помешают дублирующие препараты исследуемого образца на верхнюю сто
рону фильтра, на которой нет клеток. Жидкие экстракты и свежесмешаниые смеси помещают в
инертные кольца, находящиеся на фильтрах.
8.4.2.6 Готовят дублирующие фильтры с препаратами отрицательного и положительного кон
троля.
8.4.2.7 Инкубируют сосуды, используя условия, описанные в S.4.2.2, в течение 2 ч i 10 мин.
8.4.2.8 Осторожно удаляют препараты с фильтра и отделяют фильтр от поверхности агара.
8.4.2.9 Определяют цитотоксичность, используя адекватную методику окрашивания.
8.5 Определение цитотоксичности
8.5.1 Определяют цитотоксичность методом качественной или количественной оценки.
Качественная оценка: осматривают клетки через микроскоп, чтобы оценить изменения, на
пример. изменение обшей морфологии, вакуолизацию, расщепление, лизис клеток и целостность
мембран. Отклонение от нормальной морфологии регистрируют в отчете об исследовании описа
тельно (например не обнаружено, небольшие изменения, средние и очень значительные) или циф
рами (например 0, 1,2. 3). Описывают метод оценки в отчете.
Количественная оценка: измеряют количество погибших клеток, замедление роста клеток,
пролиферацию клеток или образование колоний. Число клеток, количество белка, высвобождение
ферментов, высвобождение витальной окраски, изменение подвижности клеток или другой изме
римый параметр, который может быть количественно оценен при помощи объективных средств.
Результаты регистрируют в отчете об исследовании.
П р и м с ч а н и с - Для отдельных методов определения цитотоксичности возможно потребуется
нулевое время или базовая линия клеточной культуры.
6