ГОСТ Р ИСО 10993.5-99
5.3 Если маточная культура линии клеток хранится, то ее хранят при температуре минус 80 “С
или ниже в соответствующей клеточной среде, содержащей вещество, защищающее от воздействия
низких температур, например диметнлсульфоксид или глицерол. Длительное хранение (от несколь
ких месяцев до многих лет) возможно только при температуре минус 130 ‘С или ниже.
5.4 Ятя исследования используют лишь клетки, не содержащие микоплазму.
Перед использованием маточные культуры исследуют надежным методом, чтобы убедиться в
отсутствии .микоплазмы.
6 Культуральная среда
6.1 Культуральная среда должна быть стерильной.
6.2 Культуральная среда с сывороткой или без нее должна соответствовать условиям, необхо
димым для роста или поддержания жизнеспособности определенной линии клеток.
Можно включить в состав среды антибиотики, убедившись, что они не оказывают отрица
тельного воздействия на исследование.
Стабильность среды культуры может различаться в зависимости от композиции и условий
хранения. Среду, содержащую сыворотку и глютамин, хранят при температуре от 2 до 8 ‘С не более
7 сут. Среду, содержащую глютамин, хранят при температуре от 2 до 8 ‘С не более I мес.
6.3 pH культуральных сред поддерживают на уровне 7.2—7.4.
7 Приготовление маточной клеточной культуры
7.1 Используя выбранную линию, готовят соответствующее количество клеток, чтобы их хва
тило на все исследование. Если клетки должны быть выращены из культур, взятых из хранилища,
где они хранились в присутствии агента, защищающего ог воздействия низких температур, этот
агент удаляют. Перед использованием клетки пересевают хотя бы один раз.
7.2 Клетки удаляют и вновь приводят во взвешенное состояние путем ферментной и/или меха
нической дезагрегации, используя наиболее подходящий метод дзя каждой линии клеток.
8 Методы исследования
8.1 Количество дублей
Для проб и контроля необходимо использовать не менее трех дублей.
8.2 Исследование вытяжек
8.2.1 Для достижения воздействия вытяжек капают определенное количество постоянно пере
мешиваемой клеточной суспензии в каждый сосуд. Равномерно распределяют клетки по поверхно
сти каждого сосуда легким вращением.
8.2.2 Выдерживают культуры при (37 ± 2) *С в воздухе в присутствии 5 % (по объему) двуокиси
углерода или без нее в соответствии с выбранной для культуральной среды буферной системой.
Исследование можно осуществлять на монослое, клетки которого прикрепляются к какому-
либо твердому субстрату, или на свежеприготовленных суспензионных клетках.
При оценке образования колоний следует использовать соответственно низкую плотность кле
ток.
8.2.3 Осматривают культуры при помощи микроскопа.
8.2.4 Проводят исследование на самой вытяжке или серин разведений вытяжки, используя для
этого культуральную среду.
Если в исследовании используют монослой, то культуральную среду следует удалить, отделить
от культуры и добавить необходимое количество вытяжки или ее разведение в каждый из сосудов.
Если в исследовании используют суспензионные клетки, то добавляют вытяжку или ее разве
дение в каждый из дублирующих сосудов сразу же после приготовления клеточной суспензии.
8.2.5 Нефизиологическую вытяжку, например воду, изучают при наиболее физиологически
совместимой концентрации при разведении в культуральной среде.
П р и м е м а н и е — Рекомендуется использовать концентрированную культуральную среду, например
2, 5 для разведенных водных вытяжек.
4