ГОСТ Р 70296—2022
6 Сущность метода
6.1 Сущность метода заключается в применении ПЦР в режиме реального времени для
сравнения количества ДНК животного (кур, быка домашнего, свиньи, лошади) и ДНК, которым служит
высококонсервативный у птиц и млекопитающих участок генома (геномный элемент VE1800). Оба
участка геномной ДНК детектируют в одной пробирке в двух независимых ПЦР с использованием спе
цифичных праймеров и зондов, меченых разными флуоресцентными красителями.
6.2 Параллельно с анализируемой пробой проводят ПЦР с тремя калибровочными стандартными
образцами, которые представляют собой смеси рекомбинантных плазмид сучастком соответствующего
видоспецифичного гена (Rarresl, RPL6, Рор1 или RPS6) и элемента VE1800. В калибровочных
стандартных образцах 10,0 %, 1,0 % и 0,1 % содержание плазмиды с соответствующим участком
видоспецифичного гена составляет 10,0 %, 1,0 % и 0,1 % от количества плазмиды с участком элемента
VE1800 соответственно. На основании разницы значений Cf для видоспецифичной последовательности
(кур, быка домашнего, свиньи, лошади) и ВК (млекопитающие и птицы) калибровочных стандартных
образцов рассчитывают относительное содержание ДНК искомого животного (% ДНК) в анализируемых
пробах при помощи электронной таблицы.
6.3 Испытание состоит из следующих этапов:
- выделение и очистка ДНК;
- мультиплексная ПЦР с использованием специфических праймеров и зондов, меченных флуо
ресцентным красителем;
- анализ и интерпретация результатов испытаний.
7 Отбор и подготовка проб
7.1 Отбор проб проводят в соответствии с нормативными документами, устанавливающими по
рядок отбора проб для конкретных групп мясной продукции, в том числе из мяса птицы.
7.2 Подготовку анализируемой пробы проводят в соответствии с ГОСТ 31719. Анализируемые
пробы в закрытых пробирках передают на выделение ДНК.
8 Выделение ДНК
Выделение ДНК из анализируемой пробы проводят набором реагентов для выделения ДНК сорб
ционным методом по 5.2 в соответствии с инструкцией к набору.
9 Приготовление калибровочных стандартных образцов
9.1 Для предотвращения контаминации концентрированные растворы плазмидной ДНК по 5.2
разводят в 10 раз. В предварительно промаркированные одноразовые пробирки вместимостью 1,5 см3
добавляют по 9 мм3 ТЕ-буфера, затем вносят по 1 мм3 соответствующего раствора плазмидной
ДНК. Далее измеряют концентрацию плазмидной ДНК в нг/мкл на спектрофотометре по 5.1. Проводят
расчет числа копий плазмид N в растворе по формуле
^ _ количество ДНК -6,022-1023^
размер плазмиды-109-650
где количество ДНК— масса ДНК в растворе, выраженная в нг;
размер плазмиды — сумма длины вектора и длины клонированного фрагмента в п. н.
9.2 Используя расчетное значение числа копий плазмиды в растворе, каждый раствор плазмидной
ДНК в отдельности доводят ТЕ-буфером до одинаковой концентрации X ■106копий в мм3, где X — одно
и то же число для всех плазмид.
9.3 Для приготовления стандартных калибровочных образцов готовят десятикратные серийные
разведения растворов плазмидной ДНК, содержащие соответствующие клонированные фрагменты
видоспецифичных генов (Rarresl, RPL6, Рор1 или RPS6). Для каждого фрагмента ДНК в отдельности
готовят серию из трех растворов с концентрациями X ■105,X ■104 и X ■103 копий в мм3.
5