ГОСТ Р 70296—2022
9.4 В предварительно промаркированные три одноразовые пробирки вместимостью 1,5 см3
добавляют по 90 мм3 ТЕ-буфера. Для приготовления раствора с концентрацией Х-105 копий в мм3 в
первую пробирку добавляют 10 мм3 соответствующего раствора плазмидной ДНК с концентрацией
Х-106 копий в мм3 и перемешивают на вортексе в течение нескольких секунд.
9.5 Осаждают капли с крышки первой пробирки кратким центрифугированием, отбирают из
нее 10 мм3 раствора плазмидной ДНК и переносят во вторую пробирку, перемешивают содержимое
пробирки на вортексе втечение нескольких секунд. Вторая пробирка в результате содержитХ-104 копий
плазмиды фрагмента ДНК в мм3.
9.6 Осаждают капли с крышки второй пробирки кратким центрифугированием, отбирают из
нее 10 мм3 раствора плазмидной ДНК и переносят в третью пробирку. Перемешивают содержимое
пробирки на вортексе в течение нескольких секунд. Третья пробирка в итоге содержит Х-103 копий
плазмиды фрагмента ДНК в мм3.
9.7 Для приготовления калибровочных стандартных образцов с 10,0 %, 1,0 % и 0,1 % содержани
ем плазмиды соответствующего видоспецифичного гена (Rarresl, RPL6, Рор1 или RPS6) смешивают
полученные серийные разведения соответствующих плазмид с плазмидой VE1800 в соотношениях,
указанных в таблице 1.
Таблица 1— Алгоритм приготовления калибровочных стандартных образцов
Калибровочный
стандартный образец
(содержание ДНК
животного, %)
Концентрация
плазмидной ДНК,
содержащей фрагмент
видоспецифичного гена,
копий в мм3
Объем плазмидной
ДНК, содержащей
фрагмент
видоспецифичного
гена, мм3
Объем раствора
плазмидной ДНК,
содержащей фрагмент
элемента VE1800C
концентрацией
Х -106 копий в мм3, мм3
Объем ТЕ-буфера,
мм3
10,0
X - 105
100
100
800
■’Ф
О
X
1,0100100800
0,1
X - 103100100800
9.8Полученные по 9.7 калибровочные стандартные образцы хранят при температуре не выше
минус 16 °С не более шести месяцев.
10 Постановка ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией
в режиме реального времени
10.1Для выявления ДНК кур (Gallus gallus) используют комплект из пары праймеров и зонда,
позволяющий амплифицировать фрагмент гена Rarresl длиной 106 п. н. (см. таблицу 2).
Таблица 2 — Праймеры изонд для выявления ДНК кур с целью полуколичественной оценки содержания
Наименование
Роль
Нуклеотидная последовательность
Положение
Rarres-F
Прямой праймер
GTGAATGAGATCCACGGAAAGA
22150529
Rarres-Z
Зонд
R6G-CAGCAAAGGGTGAAGGAGGGAT-
CA-BHQ1
22150587
Rarres-R
Обратный праймер
СТGCCCTAACTСТGCTGAAA
22150634
Примечание — Указаны позиции первого нуклеотида соответствующего олигонуклеотида в последова
тельности генома кур (Gallus gallus) с номером NC_052540.1 вбазе данных GenBank.
10.2Для выявления ДНК быка домашнего (Bos taurus) используют комплект из пары праймеров и
зонда, позволяющий амплифицировать фрагмент гена RPL6 длиной 98 п. н. (см. таблицу 3).
6