ГОСТ Р 70296—2022
Окончание таблицы 8
РеагентыОбъем на 100 реакций, мм3
Смесь дНТФ 25 ммоль/дм320
Общий объем1000
Примечание — При использовании смеси дНТФ сдругой концентрацией, ее объем на реакцию и объем
деионизованной воды меняется пропорционально.
10.6.3Срок хранения готовой «ПЦР-смеси-1» при температуре не выше минус 16 °С — не более
шести месяцев.
10.7 Постановка ПЦР
10.7.1 Постановка реакций амплификации ДНК каждой анализируемой пробы, производится не
менее чем в двух повторах. Калибровочные стандартные образцы должны быть протестированы в
двух повторах. В отдельной пробирке вместимостью 1,5 см3смешивают из расчета на каждую реакцию
следующие реагенты: 10 мм3 ПЦР-смеси-1,5 мм3 ПЦР-буфера и 0,5 мм3Taq ДНК-полимеразы по 5.21).
10.7.2 Перемешивают смесь на вортексе, кратковременно центрифугируют на микроцентрифуге
для сброса капель с крышки пробирок. Затем вносят по 15 мм3приготовленной смеси с полимеразой в
тонкостенные пробирки вместимостью 0,2 см3.
10.7.3 Используя наконечники с фильтром в пробирки вносят по 10 мм3 ДНК, выделенной в
соответствии с разделом 8. Общий объем реакционной смеси составляет 25 мм3.
10.7.4 В качестве ПКО используют смесь в равной пропорции растворов плазмидной ДНК,
содержащей клонированный фрагмент соответствующего видоспецифичного гена (Rarresl, RPL6,
Рор1 или RPS6), и плазмидной ДНК, содержащей клонированный фрагмент VE1800, с концентрацией
каждой плазмиды X ■107 копий в см3, где X — одно и то же число для всех плазмид.
10.7.5 Ставят контрольные реакции:
- отрицательный контроль ПЦР (К-) — вместо ДНК-пробы вносят в пробирку 10 мм3ТЕ-буфера;
- положительный контроль ПЦР (К+) — вместо ДНК-пробы вносят 10 мм3соответствующего ПКО;
- калибровочные стандартные образцы 10,0 %, 1,0 %, 0,1 % — вместо ДНК-пробы вносят по
10 мм3 соответствующих калибровочных стандартных образцов по 9.7.
10.8 Проведение амплификации с детекцией в режиме «реального времени»
10.8.1Помещают пробирки в амплификатор по 5.1 для проведения ПЦР в режиме реального
времени и программируют прибор в соответствии с инструкцией по эксплуатации. Программы
амплификации приведены в таблицах 9—122).
Таблица 9 — Программа амплификации при проведении полуколичественной оценки содержания ДНК кур
Стадия
Температура, °С
Время, с
Число циклов
Детекция
Удерживание
95
900
1
—
О Расчет объема Taq ДНК-полимеразы и ПЦР-буфера на реакцию проводят в соответствии с инструкцией
производителя данных реагентов взависимости от концентрации.
2) Приведенные режимы ПЦР оптимизированы на амплификаторах Rotor-Gene Q (Qiagen Германия) или
Rotor-Gene 6000 (Corbett Research Pty Ltd. Австралия) При использовании данных амплификаторов необходимо
установить оптимизацию уровня флуоресцентного сигнала: выбрать функцию «Выполнить оптимизацию при 1-
м шаге детекции», установить параметры Минимальный Сигнал — 5FI, Максимальный Сигнал — 10FI.
9