ГОСТ 32477—2013
чаном грунте (например, кварцевом песке, мелком гравии) в проточной системе с кормом для рыб в качестве
источника питания в течение нескольких лет без обновления субстрата. Главным преимуществом Lumbriculus
variegatus по сравнению с другими водными видами олигохет является его быстрое размножение в результате
быстрого роста биомассы влабораторных популяциях [1]. [6]. [9]. [10].
Методы культивирования
Условия культивирования для Lumbriculus variegatus подробно изложены в [10]. [28]. [1]. [6]. Краткое ре
зюме данных условий приведено ниже. Червей можно культивировать в больших аквариумах (57 - 80 л) при 23
*С с фотопвриодом (16 ч свет. 8 ч темнота при 100 - 1000 лк) с использованием ежедневно обновляемой при
родной воды (45 - 50 л в аквариуме). Субстрат готовят за счет разрезания небеленой коричневой бумаги на по
лоски. которые затем могут быть смешаны с водой для культивирования на несколько секунд для получения
ма леньких кусочков бумажного субстрата. Данный субстрат может быть непосредственно использован в
аквариу мах для культивирования Lumbriculus variegatus. покрывая нижнюю часть аквариума, или может
храниться в за мороженном виде в деионизированной воде для последующего использования. Субстрат, как
правило, обновля ется один раз вдва месяца.
Каждая новая культура начинается с 500 - 1000 червей, для кормления используют 10 мл суспензии, со
держащей 6 г корма для форели, три раза в неделю в проточных или обновляемых условиях. Статические или
полустатические культуры должны получать меньшее количество корма для предотвращения бактериального и
грибкового роста. Корм и бумажный субстрат должен быть проанализирован на содержание химических веществ,
которые будут использованы в тесте на биоаккумуляцию.
В этих условиях количество особей в культуре, как правило, удваивается примерно в течение 10 - 14
дней.
Lumbriculus variegatus может быть удален из культуры, например, путем просеивания субстрата мелким
ситом или отбором отдельных особей с использованием стеклянной пипетки с широким концом (около 5 мм в
диаметре) в отдельный стакан. Если субстрат также переносят в данный стакан, стакан, содержащий червей и
субстрат, выдерживают в течение ночи в проточных условиях, что позволяет удалить субстрат из стакана в то
время, когда черви остаются на дне сосуда. Затем они могут быть перенесены во вновь подготовленные аква
риумы для культивирования или использоваться для испытаний, как указано в [1] и [6]. Следует не допускать
повреждения червей, например, при использовании пипетки с оплавленными краями или шпателя из нержавею
щей стали для отбора червей.
Критическим моментом при использовании Lumbriculus variegatus в испытаниях биоаккумуляции являет
ся его режим воспроизводства (архитомия с последующим морфаллаксисом). Такое бесполое размножение при
водит к получению двух фрагментов, которые не питаются в течение определенного периода, пока не произой
дет регенерация передней или задней части тела (например. [36]. [37]). Это означает, что потребление
Lumbriculus variegatus отложений и загрязнений с приемом пищи не может проходить непрерывно, как в случав с
трубочниками, которые не размножаются путем фрагментации.
Таким образом, синхронизация должна быть выполнена для минимизации неконтролируемого размно
жения и регенерации, а также для последующей высокой изменчивости результатов испытания. Такие изменения
могут произойти, когда некоторые особи, фрагментированные и. следовательно, не потребляющие пищу в тече
ние определенного периода времени, в меньшей степени подвержены воздействию исследуемого вещества, чем
другие особи, которые не размножались во время испытания (например. [38]).
Черви должны пройти искусственную фрагментацию (синхронизацию) [65] за 10 - 14 дней до начала
экспозиции. Следует использовать больших червей, которые предпочтительно не имеют признаков недавней
фрагментации. Этих червей можно поместить на предметное стекло в каплю воды для культивирования и фраг
ментировать всредней части тела с помощью скальпеля.
Задние части тела должны быть одинакового размера и оставлены для регенерации в сосуде со средой
для культивирования, содержащей тот же субстрат, который использовался при выращивании и реконструиро
ванной воде, до начала экспозиции.
Регенерация новой передней части регистрируется, когда синхронизированные черви закалываются в
субстрат (наличие регенерации передней части тела может быть подтверждено путем проверки представитель
ной подвыборки под бинокулярным микроскопом). Считается, что после этого тестовые организмы находятся в
одинаковом физиологическом состоянии. Это означает, что при регенерации морфаллаксис происходит у син
хронизированных червей во время испытания, практически все особи, как ожидается, будут в равной степени
подвержены воздействию осадка с исследуемым веществом.
Кормление синхронизированных червей должно начаться, как только черви начнут зарываться в суб
страт или через семь дней после фрагментации. Режим кормления должен соответствовать режиму для регу
лярных культур, кормить синхронизированных червей можно тем же кормом, который будет использован в испы
тании. Червей необходимо содержать при температуре (20 ± 2) *С. После регенерации неповрежденных целых
червей одинакового размера, активно плавающих или ползающих после механического раздражения, следует
использовать в испытании. Повреждения червей следует не допускать, например, при использовании для отбора
червей пипетки с оплавленными краями или шпателя из нержавеющей стали.
При использовании Lumbriculus variegatus в испытании в связи с особенностями режима воспроизводст
ва данного вида во время теста должно происходить увеличение количества червей, если условия являются
подходящими [6]. Отсутствие воспроизводства в эксперименте биоаккумуляции с Lumbriculus variegatus должно
быть зарегистрировано и учитываться при интерпретации результатов испытания.
15