ГОСТР ИСО 19001—2013
- молекула коньюгата: флюоресцеин изотиоцианат изомер 1 (FITC);
- (F/P)-
ot
ношение: Е 495 нм!Е 278 нм =1,0 ± 0,1 соответственно молярному отношению FITC/белок
приблизительно 5;
д) обращение и хранение: стабильны в течение трех лет после выделения при температуре от 2 "С до 8
"С.
А.5.2 Предназначенное применение
А.5.2.1 Общие положения
Антитело предназначено для применения в проточной цитометрии. Антитело может быть использовано
для качественного и количественного обнаружения Г-кпеток.
А.5.2.2 Тип (типы) материала
Антитело может быть применено на суспензиях свежих и фиксированных клеток, фиксированных
ацетоном срезах криостата, на клеточных мазках.
А.5.2.3 Методика исследования реактивности антитела для проточной цитометрии
Детали методики, использованной изготовителем, следующие:
а) Собирают венозную кровь в пробирку, содержащую антикоагулянт.
b
) Изолируют одноядерные клетки путем центрифугирования на разделительной среде; в ином случае
лизируют эритроциты после стадии инкубации, указанной в перечислении d).
c) Промывают одноядерные клетки дважды с RPMI 1640 или забуференным фосфатом солевым
раствором (PBS) (0.1 моль/л фосфата. 0,15 моль/л NaCI. pH =7.4).
d) К 10 мкл коньюгированным FITC моноклональным мышиным анти-человеческим 7-клеткам, реагент
CD3, добавляют суспензию клеток, содержащую 1-10в клеток (обычно около 100 мл), и перемешивают.
Инкубируют в темноте при температуре 4 "С в течение 30 мин [для двойного окрашивания в то же время должно
быть добавлено антитело, конъюгированное R-фикоэритрином (RPE)].
е) Промывают дважды PBS + 2 % альбумин бычьей сыворотки; ресуслендируют клетки в
соответствующей жидкости для анализа на проточном цитометре.
0 В качестве негативного контроля используют иное моноклональное антитело, коньюгированное FITC
(флюоресцеин изотиоцианатом)
д) Фиксируют осажденные клетки, перемешивая с 0.3 мл параформальдегида массовой долей 1 % в
PBS. При хранении в темноте при температуре 4 "С фиксированные клетки могут содержаться до двух недель.
h) Проводят анализ на проточном цитометре.
А.5.2.4 Предлагаемое разведение
Антитело должно использоваться для проточной цитомвтрии в концентрированной форме (10 мкш’твст).
Для применении на срезах криостата и мазках клеток антитело должно быть смешано с подходящим
разбавителем в соотношении объемов (1 + 50) мкл.
А.5.2.5 Ожидаемые результаты
Антитело обнаруживает CD3 молекулу на поверхности 7-клеток. При оценке окрашивания срезов
криостатов и мазков клеток продукт реакции должен быть локализован на мембране плазмы.
Окрашивание ткани зависит от обращения и обработки ткани до окрашивания. Неправильная фиксация,
замораживание, оттаивание, промывание, высушивание, нагревание, получение срезов или загрязнение другими
тканями или жидкостями может вызвать образование артефактов или ложноотрицательные результаты.
10