ГОСТР ИСО 19001—2013
b) клон: 1D5:
c) иммуноген: рекомбинантный человеческий белок рецептора эстрогенов;
d) источник антител: моноклональное мышиное антитело, поставленное в жидкой форме как
супернатант тканевой культуры;
e) специфичность: антитело реагирует с /V-концевым доменом (A/В регион) рецептора. При
иммуноблоттинге оно реагирует с 67 «Да полипепетцдной цепью, полученной путем трансформации Escherichia
coli и трансфекции COS клеток плазмидными векторами, экспрессирующими рецептор эстрогенов. Кроме того,
антитело реагирует с цитозольными экстрактами лютеального эндометрия и клетками линии MCF-7 рака грудной
железы человека;
f) перекрестная реактивность: антитело реагирует с рецепторами эстрогенов крыс;
д) состав: супернатант культуры ткани (среда RPMI 1640, содержащая сыворотку плода теленка),
диализированный против 0,05 ммоль/л Tris/HCI, pH = 7,2. содержащий 15 ммоль/л NaNj.
- концентрация lg: 245 мг/л;
- изотип lg: lgG1;
- идентичность легкой цели: каппа.
- концентрация общего белка: 14.9 г/л:
h) обращение и хранение: стабилен до трех лет при температуре хранения от 2 *С до 8 “С.
А.4.2 Предназначенное применение
А.4.2.1 Общие положения
Антитело применяется для качественного и полукопичественного обнаружения экспрессии рецептора
эстрогенов (например, рак грудной железы).
А.4.2.2 Тип (типы) материала
Антитело может быть применено на парафинированных срезах, фиксированных формалином,
замороженных срезах, фиксированных ацетоном, и на мазках клеток. Кроме того, антитело может быть
применено для детекции антител фермент-связанным иммуносорбентным исследованием (ELISA).
А.4.2.3 Методика окрашивания для иммуногистохимии
А.4.2.3.1 Общие положения
Для парафинированных срезов тканей, фиксированных формалином, применяют разнообразные
чувствительные технологии окрашивания, в том числе иммунопероксидазную методику, технологию АРААР
(щелочная фосфагаза антищелочная фосфатаза) и авидин-биотиновые методы, например, методы LSAB
(Меченые СтрептАвидин-Биотин). Изменения антигена, такие как нагревание в 10 ммоль/л цитрагном буферном
растворе, pH =6.0, являются обязательными. Слайды не должны высушиваться при такой обработке или при
следующей процедуре иммуногистохимического окрашивания. Для окрашивания мазков клеток предложен метод
АРААР.
Детали методики, использованной изготовителем на парафинированных срезах тканей, фиксированных
формалином, для исследования реактивности антитела для иммуногистохимии, приведены в А.4.2.3.2 -
А.4.2.3.4.
А.4.2.3.2 Реагенты
А.4.2.3.2.1 Перекись водорода, массовая доля 3% в дистиллированной воде.
А.4.2.3.2.2 Трис-буфер солевой (TBS). состоящий из 0.05 моль/л Tris/HCI и 0.15 моль/л NaCI при pH =
7.6.
А.4.2.3.2.3 Первичное антитело, состоящее из моноклонального мышиного античеловеческого
рецептора эстрогенов, разведенного оптимально в TBS (см. А.4.2.3.4).
А.4.2.3.2.4 Биотинилированное козье антитело к мышиным/кроличьим иммуноглобулинам, рабочий
раствор.
Готовят этот раствор по меньшей мере за 30 мин. но не ранее, чем за 12 ч перед применением,
следующим образом:
- 5 мл TBS. pH = 7.6;
- 50 мкл биотинилированного,изолированного от аффинитета козьего антитела против
мышиных/кроличьих иммуноглобулинов в 0,01 моль/л фосфатном буферном растворе. 15 ммоль/л NaN5. в
количестве достаточном, чтобы довести конечную концентрацию до 10 - 20 мг/мл.
А.4.2.3.2.5 Комплекс СтрелтАвидин-биотин /пероксидаза хрена (StreptABComplex/HRP), рабочий
раствор.
Готовят данный раствор следующим образом:
- 5 мл TBS. pH = 7.6;
- 50 мкл СтрептАвидина (1 мг/л) в 0,01 моль/л фосфатном буферном растворе, 15 ммоль/л Na№;
- 50 мкл биотинилированной пероксидазы хрена (0.25 мг/л) в 0.01 моль/л фосфатном буферном
растворе. 15 ммоль/л NaN.;
А.4.2.3.2.6 Раствор диаминбензидинового субстрата (DAB)
Растворяют 6 мг З.З’-диаминбензидинтетрагидрохлорида в 10 мл 0,05 моль/л TBS, pH = 7,6. Добавляют
0.1 мл перекиси водорода массовой долей 3% в дистиллированной воде. Если произошла преципитация,
фильтруют.
А.4.2.3.2.7 Гематоксилин
Растворяют 1 г гематоксилина, 50 г алюминий калий сульфата. 0.1 г йодата натрия и 1,0 г лимонной
кислоты в 750 мл дистиллированной воды. Доводят до 1000 мл дистиллированной водой.
8