ГОСТРИСО 20743—2012
7.2 Хранение штаммов
7.2.1 Общие положения
Штаммы необходимо хранить в соответствии с рекомендациями изготовителей или требованиями
ЕН 12353.
В документах должны быть приведены данные об идентификации и происхождении коллекции
культур штаммов, а также о способе их хранения в лаборатории.
7.2.2 Метод с использованием керамических гранул (бус)
Получают образец с лиофилизированными бактериями определенного штамма, следуя инструк
циям. прилагаемым к данному штамму. Ресуслензируют образец в 5 мл буферного раствора TSB (см.
6.2). Получают образец суспензии и вносят его в в чашку Петри (см. 5.17). содержащую TSA (см. 6.3).
Инкубируют культуры в течение 18—24 ч при температуре (37
±
2) °С.
После инкубации используют культуру, изолированную с чашки Петри, для проверки ее чистоты.
После проверки готовят основную культуру.
Берут 0.7 мл образца бульонной культуры и распределяют его по поверхности чашки Петри, со
держащей TSA. Выращивают культуру на чашке Петри с TSA в течение 18—24 ч при определенных
для данного штамма условиях.
Добавляют 10 мл раствора, защищающего от низких температур (см. 6.13), на поверхность чашки
Петри с TSA культурой и ресуспендируют клетки в растворе, используя стерильный стеклянный шпа
тель. Образец ресуспендированных клеток с поверхности агара разводят в 100 мл раствора, защищаю
щего от низких температур, и инкубируют в течение 30 мин при температуре 20 °С.
Используя пипетку (см. 5.15). 1 мл суспензии переносят в криогенную колбу (см. 5.16), содержа
щую бусы (см. 5.19). Колбу встряхивают таким образом, чтобы распределить клеточную бактериальную
взвесь по бусам.
- Если раствор, защищающий от низких температур, содержит диметилсульфооксид. не следует
оставлять его более чем на 1 мин при комнатной температуре.
- Раствор, защищающий от низких температур, содержащий глицерин, оставляют на 30 мин
при температуре 20 °С.
- Стерильной пипеткой удаляют излишки раствора, защищающего от низких температур. Поме
щают колбы в морозильную камеру (см. 5.12) температурой минус 70 °С или ниже.
Используя метод последовательных (серийных) разведений, готовят разведения суспензии 10~6
и 10’7.По 1мл образца каждого разведения вносят в отдельные чашки Петри. Добавляют 12—15 мл пи
тательного раствора, охлажденного до температуры (45
±
1) °С. Инкубируют в течение 18—24 ч при
ус ловиях, установленных для данного штамма. Подсчитывают число бактерий на чашке Петри,
чтобы удостовериться, что суспензия содержит менее чем 5Ю еКОЕ/мл.
Хранят криогенную колбу в морозильной камере при температуре ниже минус 70 °С.
7.2.3 Метод суспензии с глицерином
Инокулируют свежевыращенную изолированную колонию в пробирку объемом 15 мл. содержа
щую 5 мл соответствующей среды. Проводят инкубацию в термостате при температуре 37 °С до на
ступления поздней логарифмической или стационарной фазы (обычно от 5 ч инкубации идо
инкубации в течение ночи).
Для каждого из штаммов, который хранится при температуре ниже минус 70 °С, готовят стериль
ную. снабженную ярлыком пробирку для низких температур.
В пробирку наливают 225 мкл стерильного 80%-ного глицерина. Затем в нео вносят 1.0 мл бак
териальной культуры (замороженный образец должен содержать 15 % глицерина). Тщательно переме
шивают. используя миксер (см. 5.4). Культуру хранят в пробирке при температуре минус 70 °С и ниже.
Для хранения любого из штаммов при температуре ниже минус 20 °С используют жидкий гли
церин. В маркированную полипропиленовую пробирку для низких температур вносят равные объемы
80%-ного глицерина и бактериальной культуры. Для предотвращения образования ледяных кристал
лов. уменьшающих жизнеспособность клеток бактерий, взвесь в пробирке тщательно перемешивают.
Помещают пробирку в морозильную камеру при температуре минус 20 °С. Через 1 неделю, по возмож
ности. проверяют жизнеспособность клеток бактерий.
Для оживления штамма после хранения в глицерине при температуре минус 70 °С используют
стерильную зубочистку, чтобы отделить частичку твердого вещества. Затем штрихом высевают клетки в
соответствующую среду. Не следует замораживать данный образец вновь, так как каждый цикл замо-
раживания/размораживания приводит к 50 % потере жизнеспособности клеток (бактерий).
7