ГОСТ ISO 10633-1—2022
В каждую пипетку вносят по 1 см3раствора имидазола формиата (см. 4.4) и дважды промывают порциями
воды по 1см3.
А.3.2 Очистка
С точностью до 0,1 мг взвешивают 25 мг сульфатазы Helix pomatia типа Н1 (см. 4.8) и растворяют в 2,5 см3
воды, после чего полученный раствор переносят по 0,5 см3в каждую из колонок, подготовленных по А.3.1. Каждую
колонку промывают 1,5 см3воды и промывной элюат отбрасывают. Затем добавляют 1,5 см30,2 моль/л раствора
ацетата натрия (см. 4.3) и собирают элюаты из пяти колонок в пробирку для определения.
Элюаты концентрируют путем фильтрации с использованием иммерсионного фильтра7) до тех пор, пока
не останется примерно 0,1 см3жидкости (сульфатаза с молярной массой более 5000 не удаляется). Добавляют
2,5 см3 воды и концентрируют еще раз, пока не останется 0,1 см3жидкости. Разводят до 2,5 см3 водой и хранят
очищенную сульфатазу в морозильной камере при минус 18 °С (в небольших количествах, чтобы было удобно
размораживать необходимое количество перед непосредственным использованием).
А.3.3 Определение активности сульфатазы
А.3.3.1 Приготовление раствора синигрина 0,15 ммоль/л, с pH 5,8
Готовят три раствора в следующей последовательности:
a) в мерную колбу вместимостью 500 см3вносят 1см3уксусной кислоты идоводят водой до метки;
b
) в мерную колбу вместимостью 500 см3вносят 1 см3этилендиамина идоводят водой до метки;
c) смешивают 73 см3раствора а) с 40 см3раствора Ь) идоводят pH до значения 5,8, используя растворы а)
или Ь) по мере необходимости.
В мерную колбу на 100 см3вносят 3 см3раствора синигрина концентрацией 5 ммоль/л (см. А.1.1) идоводят
до метки раствором с).
А.3.3.2 Анализ активности
Используя пипетку, перенести 2 см3 раствора синигрина (см. А.3.3.1) вконтрольную и измерительную кюветы
двухлучевого спектрометра (см. 5.3), с установленной длиной волны 228 нм и температурой кювет 30 °С. Вмомент
времени
t
= 0 в измерительную кювету вносят 50 мкл очищенной сульфатазы (см. А.3.2) и сразу же включают
регистратор. Регистратор выключают, когда оптическая плотность больше не меняется (Ас), строят касательную к
точке / = 0 и измеряют градиент
AAlAt.
Единица активности сульфатазы соответствует образованию 1 мкмоль/мин десульфированного синигрина
при температуре 30 °С и pH 5,8.
Активность сульфатазы Е, выраженная в единицах активности на кубический сантиметр раствора
сульфатазы, вычисляют по формуле
ДА V 1000
1 0
At
Д
50
Е
--------------------—
нл6
,
(А.1)
е
где А
А/At
— градиент касательной к точке
t
= 0, в единицах оптической плотности в минуту;
V
— объем реакционной среды (2,05 • 10-3), л;
Ае — (приблизительно 1500 л моль-1 см-1), разница между молярным коэффициентом поглощения
синигрина и десульфосинигрина при 228 нм, то есть
(А-2)
где
Ае
— разница между оптической плотностью десульфированного синигрина в состоянии равновесия и
оптической плотностью в момент времени / = 0;
/ — длина оптического пути кюветы, см (т. е. 1 см);
с — концентрация десульфированного синигрина при равновесии, моль/дм3,то есть
0,15>КГ3 0,95-2
2,05
1.39.10-3,
(А.З)
где 0,95 — выход десульфированного синигрина при равновесии.
7) Millipore PLGC 11К25 — пример подходящего и коммерчески доступного продукта. Эта информация дана
для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламной поддержкой данного реактива.
10