13
обезжиривают два раза по 3 см3 н-Гексаном. Водно-метанольную фракцию очищают методом твердофазной экстракции (ТФЭ), а затем методом ВЭЖХ.
Если интересующие компоненты представлены в виде эфиров (например, гестагены или ацетат тренболона), дополнительно проводят их щелочной гидролиз. Для этого сухой остаток растворяют в 0,2 см3 щелочного раствора для гидролиза (6.3.2) и помещают на нагревательный модуль при температуре 37 °С на 30 мин. Гидролиз останавливают добавлением 1 см3 «кислого» буферного раствора (6.3.4) и обезжиривают два раза по 3 см3 н-Гексаном.
- Пробу печени или почек измельчают на гомогенизаторе и взвешивают на лабораторных весах по 5,0 г гомогенизированной пробы в двух флаконах вместимостью по 40 см3. Во флаконы добавляют по 15 см3 ацетатного буферного раствора (6.3.3) и 50 мм3 пищеварительного сока Helix pomatia. Пипеточным дозатором вносят по 50 мм3 раствора дейтерированных стандартных образцов массовой концентрации 10 нг/см3 и ставят флаконы на нагревательный модуль при температуре 37 °С на 15 ч для ферментативного гидролиза коньюгатов стероидов. После гидролиза флаконы с образцами охлаждают до комнатной температуры, добавляют 2 см3 соляной кислоты и экстрагируют два раза по 15 см3 метил-трет-бутиловым эфиром. При неполном отделении метил-трет-бутилового эфира флаконы с образцами помещают на центрифугу и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 3 мин. Объединенные эфирные экстракты переносят в круглодонную колбу и упаривают на ротационном испарителе досуха. Сухой остаток растворяют в 4 см3 метанола, затем приливают 1 см3 деионизованной воды и обезжиривают два раза по 3 см3 н-Гексаном. Водно-метанольную фракцию очищают методом ТФЭ (7.2), а затем методом ВЭЖХ (7.3).
- Во флакон вносят 10 см3 мочи, 10 см3 ацетатного буферного раствора (6.3.3) и 100 мм3 пищеварительного сока Helix pomatia. Пипеточным дозатором вносят 50 мм3 раствора дейтерированных стандартных образцов массовой концентрации 10 нг/см3 и ставят флаконы на нагревательный модуль при температуре 52 °С на 15 ч для ферментативного гидролиза коньюгатов стероидов. Энзиматический гидролизат охлаждают до комнатной температуры и очищают методом ТФЭ (7.2), а затем методом ВЭЖХ (7.3).
- Во флакон вносят 5 см3желчи, 15 см3 ацетатного буферного раствора (6.3.3) и 100 мм3 пищеварительного сока Helix pomatia. Далее проводят обработку пробы в соответствии с 7.1.3.
- 5 г жира взвешивают на лабораторных весах в стеклянном флаконе вместимостью 40 см3. Во флакон добавляют 20 см3 н-Гексана и 10 см3 ацетонитрила. Пипеточным дозатором вносят 50 мм3 раствора дейтерированных стандартных образцов массовой концентрации 10 нг/см3. Помещают флакон на ультразвуковую баню на 15 мин до полного растворения жира. Затем интенсивно перемешивают, флакон с образцом помещают на центрифугу и центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 мин. Ацетонитрильную фракцию отбирают и повторяют жидкостно-жидкостную экстракцию 10 см3 ацетонитрила. Объединенные ацетонитрильные фракции упаривают досуха на ротационном испарителе. Сухой остаток растворяют в 1 см3 метанола, а затем приливают 1 см3 деионизованной воды и обезжиривают два раза по 3 см3 н-Гексаном. Водно-метанольную фракцию очищают методом ТФЭ (7.2), а затем методом ВЭЖХ (7.3).
- 100 г кормов измельчают на гомогенизаторе и взвешивают на лабораторных весах по 5,0 г гомогенизированной пробы в двух флаконах вместимостью по 40 см3. Во флаконы добавляют 20 см3 раствора метанола и деионизованной воды, взятых в соотношении 80:20, и пипеточным дозатором вносят по 50 мм3 раствора дейтерированных стандартных образцов массовой концентрации 10 нг/см3. Помещают флаконы на ультразвуковую баню на 20 мин. Затем интенсивно перемешивают, флаконы с образцами помещают на центрифугу и центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 мин. Надосадоч- ный слой обезжиривают два раза по 5 см3 н-Гексана и упаривают на ротационном испарителе при температуре 40 °С до окончания упаривания метанола. Водный остаток очищают методом ТФЭ (7.2), а затем методом ВЭЖХ (7.3).
- Очистка методом твердофазной экстракции
Картриджи для ТФЭ объемом 12 см3 c 1 г сорбента C18 40 мкм кондиционируют на вакуумном устройстве для ТФЭ, пропуская последовательно 10 см3 метанола и 4 см3 деионизованной воды. К вод- но-метанольному экстракту, полученному после стадий экстракции в соответствии с 7.1.1 —7.1.6, приливают 15 см3 деионизованной воды и пропускают через кондиционированный картридж со скоростью элюирования не более двух капель в секунду. Промывают картридж последовательно 2 см3 деионизованной воды, 10 см3 раствора метанола и деионизованной воды, взятых в соотношении 20:80,5 см3 раствора метанола и деионизованной воды, взятых в соотношении 40:60. Элюируют аналиты 10 см3 раствора метанола и деионизованной воды, взятых в соотношении 80:20. Упаривают элюат на ротационном испарителе при температуре от 45 °С до 48 °С до 1 или 1,5 см3. Водный остатокочищают методом ВЭЖХ.
- Очистка методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
Систему ВЭЖХ с бинарным градиентом и спектрофотометрическим детектором подготавливают в соответствии с руководством по эксплуатации прибора. Вместо петли инжектора устанавливают предколонку С18. Разделение анаболических стероидов и производных стильбена проводят на анали