ГОСТ Р 57196—2016
- линейка по ГОСТ 14735:
- лотокстеклянный из оргстекла или чашки Петри по ГОСТ25336:
- кислотасоляная поГОСТ 3118. растворы концентраций 0,01 и0,2 моль/дм3;
- кислота уксусная по ГОСТ61;
- бутанол-1 по ГОСТ 6006;
- спирт этиловый по ГОСТ 18300 или по ГОСТ 5962;
- пиридин по ГОСТ 13647;
- нингидрин. 0,25 %-ный раствор в этаноле, содержащем 1%уксусной кислоты:
- бацитрацин стандартныйобразец, растворс активностью 1000 ЕД в 1см3в соляной кислотекон
центрации0.01 моль/дм3.
5.6.2 Подготовка киспытанию
5.6.2.1 Приготовление испытуемой пробы
5 г препарата помещают в ступку и растирают при добавлении 25 см3раствора соляной кислоты
концентрации 0.2 моль/дм3. Суспензию переносят в колбу, ступку обмывают 25 см3 раствора соляной
кислоты концентрации 0.2 моль/дм3итакже сливают в колбу. Колбу закрывают пробкой, ставят на аппа
ратдля встряхивания на 30 мим. Затем содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр.
Фильтратиспользуютдля проведения испытания.
5.6.2.2 Подготовка хроматографической камеры
В камеру или эксикатор ставят стаканчик со смесью растворителей, состоящей из бутанола-1,
пиридина, уксусной кислоты и воды в соотношении 15:10:3:12. На дно камеры кладутфильтровальную
бумагу, смоченную этойже смесью.
5.6.2.3 Подготовка хроматографической бумаги
Из листа хроматографической бумаги вырезают кругидиаметром 28— 32 см (в зависимостиотраз
мера камеры). Из центра круга циркулем проводят окружность радиусом 2 см. Круг делят на шесть раз
ных секторов, в центре круга делают отверстие диаметром 0.5 см для фитиля, который скручивают из
кусочкафильтровальной бумаги.
5.6 2.4 Подготовка газонадля биоавтографии
В стеклянный лоток наливают 100 см3 голодной агаровой среды и 80 см3 питательной агаровой
среды с тест-культурой Вас. subtilis 6633.
5.6.3 Проведение испытания
5.6.3.1 На два противоположныхсектора круга (на отрезокдуги внутренней окружности) микропи
петкой наносят раствор стандартного образца бацитрацин в соляной кислоте концентрации 0,01
моль/дм3в количестве 0.1 см3. Таким же образом наносят растворы двух испытуемых проб. Для
бацилихина-40объем наносимой пробы составляет 0,025 см3,для бацилихииа-10 — 0.1 см3.При нане
сении проб хроматограммы периодически просушивают феном. После нанесения проб в отверстие в
центредиска вставляютфитильихроматограмму помещают в камерутак, чтобы фитиль был погружен в
растворитель.
Для лучшего разделения компонентов гризинового комплекса хроматографирование проводят в
течение 15— 16 ч. После окончания процесса хроматограмму вынимают из камеры и высушивают в
вытяжном шкафу. Затем хроматограмму разрезают подиаметру надве части, так чтобы в каждой из них
был сектор со стандартным образцом исекторы сдвумя исследуемыми образцами.
5.6.3.2 Одну половину хроматограммы проявляют биоавтографическим способом, для чего из
каждогосекторахроматограммы в радиальном направлении вырезают полоски шириной0,5 см и накла
дывают их на газон с тест-культурой параллельноодна другой на расстоянии 2см, совмещая их старто
вую линию. На обратнойстороне лотка отмечают стартовую линию и положение каждой полоски. Через
3—5 мин полоски снимают пинцетом.
Лотокс газоном помещают в термостатс температурой 37 вС на 18—20 ч.
5.6.3.3Вторую половину хроматограммы опрыскивают 0,25 %-ным раствором нингидрина
вэталоне с 1%-ным растворомуксусной кислоты ивысушиваютв вытяжном шкафу. Из нингидрииоокра-
шенныхполосокхроматограммы стандартногообразца исоответствующихим полосокхроматограммы
испытуемых проб в радиальном направлении вырезают квадраты размером 0.5 *0.5 см и накладывают
их на газонс тест-культурой. Лотокс газоном помещают в термостатс температурой 37 °С на 18—20 ч.
5.6.4 Обработка результатов
Появление нингидриноокрашенных компонентов на хроматограмме, совпадающихпо положению
с нингидриноокрашенными компонентамистандартногообразца бацитрацин, а такжезон задержки рос
та тест-культуры от испытуемых компонентов пробысвидетельствуето подлинности препарата.
ю